Toveis retroviral integrasjonssted PCR-metodikk og kvantitativ dataanalyse arbeidsflyt
Summary
Dette manuskriptet beskriver eksperimentell prosedyre og programvareanalyse for en toveis integreringsstedanalyse som samtidig kan analysere oppstrøms og nedstrøms vektor-vert-kryss-DNA. Toveis PCR-produkter kan brukes til alle nedstrøms sekvenseringsplattformer. De resulterende dataene er nyttige for en høy gjennomstrømning, kvantitativ sammenligning av integrerte DNA-mål.
Abstract
Integrasjonssted (IS) analyser er en kritisk komponent i studien av retrovirale integrasjonssteder og deres biologiske betydning. I nyere retrovirale genterapi-studier har IS-analyser, i kombinasjon med neste generasjons sekvensering, blitt brukt som et celle-sporingsverktøy for å karakterisere klonale stamcellepopulasjoner som deler samme IS. For nøyaktig sammenligning av repopulerende stamcellekloner i og over forskjellige prøver, er gjenkjenningsfølsomheten, data-reproducerbarheten og høy gjennomstrømningskapasiteten til analysen blant de viktigste analysekvaliteter. Dette arbeidet gir en detaljert protokoll- og dataanalyseprosess for toveis-IS-analyse. Den toveisanalyse kan samtidig sekvensere både oppstrøms og nedstrøms vektor-vert-kryssinger. Sammenlignet med konvensjonelle ensrettede IS-sekvenseringsmetoder, forbedrer bidireksjonell tilnærming signifikant IS-detekteringshastigheter og karakteriseringen av integrasjonshendelser i begge ender av tHan målretter seg mot DNA. Dataanalysepipelinjen som er beskrevet her, identifiserer og oppregner nøyaktig identiske IS-sekvenser gjennom flere trinn for sammenligning som kartet IS-sekvenser på referansegenomet og bestemmer sekvenseringsfeil. Ved hjelp av en optimalisert analyseprosedyre har vi nylig publisert detaljerte repopulasjonsmønstre av tusenvis av hematopoietiske stamceller (HSC) kloner etter transplantasjon i rhesus macaques, som for første gang demonstrerte det presise tidspunktet for HSC-repopulasjon og den funksjonelle heterogeniteten av HSCs i Primatsystem. Følgende protokoll beskriver trinnvis eksperimentell prosedyre og dataanalyseprosess som nøyaktig identifiserer og kvantifiserer identiske IS-sekvenser.
Introduction
Retrovirus setter deres genomiske DNA inn i vertsgenomet på forskjellige steder. Denne unike egenskapen, som kan bidra til utvikling av kreft og andre former for viral patogenese, har den ironiske fordelen ved å gjøre disse virusene svært mottagelige for celleteknikk for genterapi og grunnleggende biologisk forskning. Viral Integration Site (IS) – plasseringen på vertsgenomet der et fremmed DNA (virus) er integrert – har viktige implikasjoner for skjebnen til både de integrerte virusene og vertscellene. IS-analyser har vært brukt i ulike biologiske og kliniske forskningsinnstillinger for å studere retroviral integrasjonsstedseleksjon og patogenese, kreftutvikling, stamcellebiologi og utviklingsbiologi 1 , 2 , 3 , 4 . Lav deteksjonsfølsomhet, dårlig datareproducerbarhet og hyppig krysskontaminering er blantNøkkelfaktorene begrenser bruken av IS-analyser til nåværende og planlagte studier.
Mange IS analyseteknologier er blitt utviklet. Restriksjonsenzymbaserte integrasjonsstedanalyser, inkludert Linker-Mediated (LM) Polymerase Chain Reaction (PCR) 5 , inverse PCR 6 og Linear Amplification-Mediated (LAM) PCR 7 , er de mest brukte. Bruken av stedsspesifikke restriksjonsenzymer genererer imidlertid en bias under gjenvinning av IS, slik at bare en delmengde av integromer (et fremmed DNA integrert i vertsgenomet) i nærheten av restriksjonsstedet som skal gjenvinnes 4 . Analyseteknologier som mer omfattende vurderer vektor IS har også blitt introdusert de siste årene. Disse analysene anvender forskjellige strategier, inkludert Mu transposon-mediert PCR 8 , ikke-restriktiv (nr) -LAM PCR 9 , type II restriksjon enzym-mEdiert fordøyelse 10 , mekanisk skjæring 11 og tilfeldig heksamerbasert PCR (Re-fri PCR) 12 , for å fragmentere genomiske DNAer og amplifisere IS. Nåværende teknologier har varierende nivåer av deteksjonsfølsomhet, genomet dekning, målspesifikitet, høy gjennomstrømningskapasitet, kompleksitet av analyseprosedyrer og forstyrrelser ved å detektere de relative frekvensene av målsteder. Gitt de varierende egenskapene til de eksisterende analysene og de forskjellige formål som de kan brukes til, bør den optimale analysemetoden velges nøye.
Dette arbeidet gir detaljerte eksperimentelle prosedyrer og en beregningsdataanalyseprosess for en toveisanalyse som betydelig forbedrer deteksjonshastigheten og sekvenskvantifiseringsnøyaktigheten ved samtidig å analysere IS oppstrøms og nedstrøms for det integrerte mål-DNA (se figur 1 for en skjematisk oversikt over analyseprosedyrene ). Denne tilnærmingen gir ogsåS måten å karakterisere den retrovirale integrasjonsprosessen (for eksempel påliteligheten til målstedduplisering og variasjoner i de genomiske sekvensene av oppstrøms og nedstrøms innføringer). Andre bidireksjonelle metoder har blitt brukt primært for kloning og sekvensering av begge ender av mål-DNA 11 , 13 , 14 . Denne analysen er i stor grad optimalisert for høy gjennomstrømning og reproduserbar kvantifisering av vektormerkede kloner ved bruk av den veletablerte LM-PCR-metoden og beregningsanalysekartlegging og for kvantifisering av både oppstrøms og nedstrøms kryssinger. Toveisanalyse med TaqaI- enzymet har vist seg nyttig for høyt gjennomstrømmende klonal kvantifisering i stamcellegenterapi prekliniske studier 2 , 15 . Dette papiret beskriver en modifisert metode ved hjelp av en hyppigere kutter (RsaI / CviQI – motiv: GTAC) som dobler tHan sjanser til å oppdage integromer i forhold til en TaqaI- basert analyse . Detaljert eksperimentelle og dataanalyseprosedyrer som bruker GTAC-motiv-enzymer for lentiviral (NL4.3 og dets derivater) og gamma-retroviral (pMX vektorer) vektor IS-analyse, er beskrevet. Oligonukleotidene anvendt i analysen er oppført i tabell 1 . Et internt programmeringsskript for IS-sekvensanalyse er gitt i tilleggsdokumentet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den toveisanalyse muliggjør samtidig analyse av både oppstrøms (venstre) og nedstrøms (høyre) vektor-vert-DNA-krysssekvenser og er nyttig i en rekke genterapi-, stamceller- og kreftforskningsapplikasjoner. Bruken av GTAC-motiv-enzymer (RsaI og CviQI) og den toveire PCR-tilnærmingen øker sjansene for å oppdage en integrometall (eller en klonal populasjon) sammenlignet med tidligere TCGA- motivenzym ( TaqaI ) -baserte analyser 2 , 15 og a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering ble gitt av National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 og R56 HL126544; National Science Foundation Grant DMS-1516675; Nasjonalt forskningsfond i Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Og KRIBB-initiativet.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
