تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب
Summary
هنا، نحن تصف تطبيق الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) لتحليل الفجوة تقاطع تعتمد على مكوك من ميرنا. على النقيض من الأساليب المطبقة عادة، 3D-فراب يسمح لكمية النقل بين الخلايا من الحمض النووي الريبي الصغيرة في الوقت الحقيقي، مع ارتفاع القرار المكاني والزماني.
Abstract
الرنا الصغيرة المضادة للعدوى، مثل ميرنا و سيرنا، تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلوية وعلم الأمراض، وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم كعوامل علاجية في علاج العديد من الأمراض. ويستند تطوير استراتيجيات جديدة ومبتكرة للعلاج ميرنا / سيرنا على معرفة واسعة من الآليات الكامنة. وتشير البيانات الأخيرة إلى أن رنا صغيرة يتم تبادلها بين الخلايا بطريقة تعتمد على تقاطع الفجوة، وبالتالي إحداث آثار تنظيمية الجينات في الخلية المتلقية. وتستخدم التقنيات البيولوجية الجزيئية وتدفق تحليل سايتوميتريك عادة لدراسة التبادل بين الخلايا من ميرنا. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا توفر القرار الزماني العالي، وهو أمر ضروري عند دراسة الفجوة تدفق وظيفية من الجزيئات. لذلك، للتحقيق في تأثير ميرنا / سيرنا كما جزيئات الإشارات بين الخلايا، وهناك حاجة إلى أدوات جديدة من شأنها أن تسمح لتحليل هذه الرنا الصغيرة على المستوى الخلوي. يصف هذا البروتوكول أبتقطيع الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) المجهري لتوضيح التبادل تعتمد على تقاطع الفجوة من جزيئات ميرنا بين خلايا القلب. الأهم من ذلك، وهذا نهج التصوير الخلية الحية مباشرة وغير الغازية يسمح لتصور وتقدير من الفجوة التكتيكية الوصفي من رنا صغيرة فلورزنتلي المسمى في الوقت الحقيقي، مع قرار المكاني والزماني عالية. البيانات التي تم الحصول عليها من قبل 3D-فراب تؤكد مسار جديد من تنظيم الجينات بين الخلايا، حيث رنا الصغيرة بمثابة الجزيئات إشارة داخل الشبكة بين الخلايا.
Introduction
الرنا الصغيرة غير المشفرة هي لاعبين مهمين في تنظيم الجينات الخلوية. وتتكون هذه الجزيئات من 20-25 النيوكليوتيدات التي ترتبط مرنا الهدف محددة، مما يؤدي إلى انسداد الترجمة أو إلى مرنا تدهور 1 ، 2 . العملية التنظيمية الجينية التي تقوم بها الرنا الصغيرة، مثل ميرنا و سيرنا، هو آلية المحافظة للغاية التي تم العثور عليها في العديد من الأنواع المختلفة 3 . على وجه الخصوص، جزيئات ميرنا ذات أهمية حاسمة لمجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك الانتشار، والتمايز، والتجديد 4 ، 5 . وبالإضافة إلى ذلك، يعزى إلى عدم انتظام التعبير ميرنا لكثير من الاضطرابات المرضية. في المقابل، وقد ثبت ميرناس لتكون مناسبة كما المؤشرات الحيوية للتشخيص وكعوامل علاجية للعلاج الجيني 6 ، 7 </suص>.
تقاطعات الفجوة (غس) هي هياكل البروتين المتخصصة في غشاء البلازما من اثنين من الخلايا المجاورة التي تسمح التبادل المنتشر للجزيئات مع الوزن الجزيئي تصل إلى 1 كيلو دالتون. وقد تبين أنها مهمة لتطوير الأنسجة، والتمايز، والموت الخلية، والاضطرابات المرضية مثل السرطان أو أمراض القلب والأوعية الدموية 8 ، 9 ، 10 . وقد وصفت عدة جزيئات بأنها قادرة على عبور قنوات جي جي، بما في ذلك الأيونات، الأيض، والنيوكليوتيدات. ومن المثير للاهتمام، تم العثور على غس أيضا لتوفير مسار للحركة بين الخلايا من الرنا الصغيرة 11 ، 12 . وهكذا، ميرناس يمكن أن تعمل ليس فقط داخل الخلية التي يتم إنتاجها، ولكن أيضا داخل الخلايا المتلقية. هذا يسلط الضوء على دور ميرناس في نظام التنبيه إشارة بين الخلايا. وفي الوقت نفسه، تظهر البياناتأن الفجوة التواصل بين الخلايا اتصال بين يرتبط ارتباطا وثيقا وظيفة ميرنا. بسبب تأثير كبير من ميرنا و غس على التوازن الأنسجة، علم الأمراض، والتشخيص، وفهم شامل لوظيفة غس والديناميات بين الخلايا ذات الصلة ميرنا تساعد على توضيح آليات الأمراض القائمة على ميرنا ووضع استراتيجيات جديدة ل ميرنا العلاجات.
اعتمادا على مدى الفجوة اقتران الوصلي، ونقل جزيئات ميرنا بين الخلايا يمكن أن تكون عملية سريعة جدا. لذلك، هناك حاجة إلى منهجية تسمح التصور وكمية الحركة بين الخلايا السريعة من هذه الجزيئات تشوير التنظيمية. عادة، وقد تم تطبيق التدفق الخلوي والتقنيات البيولوجية الجزيئية لإثبات المكوك من الرنا الصغيرة 11 ، 12 ، 13 ، 14 . ومع ذلك، بدلا من ميكروس فرابنسخ، هذه النهج تفتقر إلى القرار الزماني عالية، وهو إلزامي عند تحليل تبادل ميرنا عبر غس. وعلاوة على ذلك، فراب المجهري هو أقل الغازية، وبالتالي يمثل قوية ورواية الخلية الحية تقنية التصوير لتقييم تبادل غ تعتمد على جزيئات في عدة أنواع الخلايا 15 ، 16 ، 17 .
هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف تطبيق 3D-فراب لتقييم ميرنا المكوك بين الخلايا العضلية. لهذا الغرض، تم ترانزفكتد كارديوميوسيتس مع ميرنا فلورزنتلي المسمى. وكانت خلية ملحوظ مع هذا ميرنا فوتوبلاشد، وسجل فجوة ميرنا الوريد إعادة تدفق من الخلايا المجاورة سجلت بطريقة تعتمد على الوقت. القرار الزماني العالي للتجارب فراب يوفر إمكانية لإجراء دراسات الحركية لتقييم دقيق لنقل بين ميرنا و سيرنا بين الخلايا الحية. Moreoحيث يمكن تبادل رنا صغيرة عن طريق آليات مختلفة مع حركية مختلفة للغاية، يمكن أن يساعد المجهر فراب لتوضيح مدى مشاركة غس في عمليات المكوكية ذات الصلة 18 . وبالإضافة إلى ذلك، 3D-فراب يمكن استخدامها للتحقيق في التغيرات الفسيولوجية والمرضية في نفاذية غ وأثره على نقل الحمض النووي الريبي الصغيرة 15 ، 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
ميرناس هي اللاعبين الرئيسيين في علم وظائف الأعضاء الخلوية، وتبين أنها تعمل كجزيئات الإشارات باستخدام-من بين أمور أخرى-غس كمسار لتبادل بين الخلايا 11 ، 12 ، 22 . يعرض البروتوكول الحالي تقنية التصوير في الخلية الحية <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل الوزارة الاتحادية للتعليم والبحث في ألمانيا (فكز 0312138A و فكز 316159)، و مكلنبورغ-ويسترن بوميرانيا الحكومية مع صناديق الاتحاد الأوروبي الهيكلية (إسف / إيفوم-B34-0030 / 10 و إسف / إيفبم-B35-0010 / 12)، و دفغ (DA1296-1)، ومؤسسة القلب الألمانية (F / 01/12). وبالإضافة إلى ذلك، ويدعم أردي من قبل برنامج فورون من المركز الطبي جامعة روستوك (889001)، ومؤسسة دامب، و بمبف (فيب + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA – A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
