Qui descriviamo l'applicazione del recupero di fluorescenza tridimensionale dopo la fotopolimerizzazione (3D-FRAP) per l'analisi della shuttling di miRNA dipendente dalla giunzione di giunzione. In contrasto con i metodi comunemente applicati, il 3D-FRAP consente la quantificazione del trasferimento intercellulare di piccoli RNA in tempo reale, con un'elevata risoluzione spaziatura temporale.
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Articolo metodologico
Analisi del trasferimento di gig Junction-dependent di miRNA con la microscopia 3D-FRAP
In questo articolo
Sommario
Abstract
I piccoli RNA antisensivi, come miRNA e siRNA, svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare e nella patologia e, inoltre, possono essere utilizzati come agenti terapeutici nel trattamento di diverse malattie. Lo sviluppo di nuove strategie innovative per la miRNA / siRNA terapia si basa su una vasta conoscenza dei meccanismi sottostanti. Recenti dati suggeriscono che piccoli RNAs siano scambiati tra le cellule in un modo di dipendenza dalla giunzione gap, inducendo quindi effetti regolatori genetici nella cellula ricevente. Le tecniche biologiche molecolari e l'analisi citometrica a flusso sono comunemente utilizzate per studiare lo scambio intercellulare di miRNA. Tuttavia, questi metodi non forniscono una elevata risoluzione temporale, che è necessaria quando si studia il flusso junctional gap delle molecole. Pertanto, per studiare l'impatto di miRNA / siRNA come molecole di segnalazione intercellulare, sono necessari nuovi strumenti che consentiranno l'analisi di questi piccoli RNA a livello cellulare. Il presente protocollo descrive l'apPlicazione del recupero tridimensionale di fluorescenza dopo la microscopia fotoblaccante (3D-FRAP) per chiarire lo scambio di giunzioni dipendente dalle molecole di miRNA tra le cellule cardiache. Importante, questo approccio semplice e non invasivo di immagini viva-cellule consente la visualizzazione e la quantificazione del gap junctional shuttling di piccoli RNA a fluorescenza etichettati in tempo reale, con un'elevata risoluzione spaziatura temporale. I dati ottenuti da 3D-FRAP confermano un nuovo percorso di regolazione delle cellule intercellulari, dove i piccoli RNA agiscono come molecole di segnalazione all'interno della rete intercellulare.
Introduzione
I piccoli RNA non codificanti sono importanti attori nella regolazione del gene cellulare. Queste molecole sono composte da 20-25 nucleotidi che si legano ad un specifico mRNA bersaglio, portando al blocco della traduzione o al degradazione mRNA 1 , 2 . Il processo di regolazione del gene intrapreso da piccoli RNA, come miRNA e siRNA, è un meccanismo altamente conservato che è stato trovato in molte specie diverse 3 . In particolare, le molecole di miRNA sono di cruciale importanza per una varietà di processi fisiologici, compresa la proliferazione, la differenziazione e la rigenerazio....
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Protocollo
Tutte le fasi di questo protocollo che coinvolgono topi neonatali sono stati eseguiti per le linee guida etiche per la cura degli animali del Centro medico universitario di Rostock.
1. Preparazione dei piatti della cultura cellulare e del mezzo per la cultura cardiomiocitaria
- Applicare una piastra di coltura cellulare con gelatina 0,1% in PBS e incubare a 37 ° C per 4 ore oa 4 ° C per una notte. Rimuovere la gelatina e lasciarlo asciugare sotto il flusso laminare aria sterile.
- Preparare il mezzo di coltura cellulare composto da 50 ml di DMEM integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptom....
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Risultati
Qui presentiamo la microscopia 3D-FRAP come una tecnica non invasiva per studiare la distanza di giunzione giunzionale del miRNA fluorescente nei cardiomiociti neonatali. I cardiomiociti isolati hanno rivelato il tipico pattern di α-actina striato e contenevano grandi placche di Cx43 lungo i bordi delle cellule cellulari ( Figura 1A , frecce bianche), che hanno permesso l'elevato flusso intercellulare delle molecole. La purezza dei cardiomiociti isolati .......
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Discussione
MiRNAs sono attori chiave della fisiologia cellulare e sono stati dimostrati di agire come molecole di segnalazione utilizzando, tra gli altri, GJs come percorso per lo scambio intercellulare 11 , 12 , 22 . Il protocollo attuale presenta una tecnica di imaging in vivo in vitro per caratterizzare questa shuttling dipendente dal GJ utilizzando miRNA fluorescenti all'interno dei cluster di cellule.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero Federale dell'Istruzione e della Ricerca Germania (FKZ 0312138A e FKZ 316159), lo Stato Meclemburgo-Pomerania Occidentale con i Fondi Strutturali dell'UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 e ESF / IVBM-B35-0010 / 12), il DFG (DA1296-1) e la Fondazione tedesca del cuore (F / 01/12). Inoltre, RD è supportato dal programma FORUN di Rostock University Medical Center (889001), dalla Fondazione DAMP e dal BMBF (VIP + 00240).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| topi neonatali NMRI | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0,1% soluzione in PBS, sterilizzato |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´ s terreno modificato | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillina/Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µ g/mL |
| Siero fetale bovino | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Kit di isolamento dei cardiomiociti primari | |||
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | incluso nel kit di isolamento dei cardiomiociti primari |
| microRNA marcato miRIDIAN Dy547 Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | si dissolve in acqua priva di RNAsi, soluzione madre 20µ M |
| Fosfato di sodio monobasico | Sigma | S3139 | |
| Fosfato di sodio bibasico | Carl Roth | T877.2 | |
| Cloruro di potassio | Sigma | P9333 | |
| Cloruro di magnesio | Serva | 28305.01 | |
| Succinato di sodio | Carl Roth | 3195.1 | |
| Soluzione di tripsina/EDTA allo 0,05% | Merck | L2153 | |
| Vetrini a 4 pozzetti con camera inferiore in vetro | IBIDI | 80827 | rivestimento con soluzione di gelatina allo 0,1% |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | Il programma G-009 è stato utilizzato per l'elettroporazione. | |
| Sistema LSM 780 ELYRA PS.1 | Zeiss | ||
| Excel Anticorpo | Microsoft | ||
| α-actinina | Abcam | ab9465 | diluizione 1:200 |
| Anticorpo Connexin43 | Santa Cruz | sc-9059 | diluizione 1:200 |
| capra anti-topo Alexa 594 anticorpo | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | diluizione 1:300 |
| capra anti-coniglio Alexa 488 anticorpo | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | diluizione 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | concentrazione finale 250 nM |
| Near-IR Kit di colorazione di cellule vive/morte | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI colorazione nucleare | Thermo Scientific | D1306 |
Riferimenti
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature
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Ristampe e permessi
