Analisi del trasferimento di gig Junction-dependent di miRNA con la microscopia 3D-FRAP
Summary
Qui descriviamo l'applicazione del recupero di fluorescenza tridimensionale dopo la fotopolimerizzazione (3D-FRAP) per l'analisi della shuttling di miRNA dipendente dalla giunzione di giunzione. In contrasto con i metodi comunemente applicati, il 3D-FRAP consente la quantificazione del trasferimento intercellulare di piccoli RNA in tempo reale, con un'elevata risoluzione spaziatura temporale.
Abstract
I piccoli RNA antisensivi, come miRNA e siRNA, svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare e nella patologia e, inoltre, possono essere utilizzati come agenti terapeutici nel trattamento di diverse malattie. Lo sviluppo di nuove strategie innovative per la miRNA / siRNA terapia si basa su una vasta conoscenza dei meccanismi sottostanti. Recenti dati suggeriscono che piccoli RNAs siano scambiati tra le cellule in un modo di dipendenza dalla giunzione gap, inducendo quindi effetti regolatori genetici nella cellula ricevente. Le tecniche biologiche molecolari e l'analisi citometrica a flusso sono comunemente utilizzate per studiare lo scambio intercellulare di miRNA. Tuttavia, questi metodi non forniscono una elevata risoluzione temporale, che è necessaria quando si studia il flusso junctional gap delle molecole. Pertanto, per studiare l'impatto di miRNA / siRNA come molecole di segnalazione intercellulare, sono necessari nuovi strumenti che consentiranno l'analisi di questi piccoli RNA a livello cellulare. Il presente protocollo descrive l'apPlicazione del recupero tridimensionale di fluorescenza dopo la microscopia fotoblaccante (3D-FRAP) per chiarire lo scambio di giunzioni dipendente dalle molecole di miRNA tra le cellule cardiache. Importante, questo approccio semplice e non invasivo di immagini viva-cellule consente la visualizzazione e la quantificazione del gap junctional shuttling di piccoli RNA a fluorescenza etichettati in tempo reale, con un'elevata risoluzione spaziatura temporale. I dati ottenuti da 3D-FRAP confermano un nuovo percorso di regolazione delle cellule intercellulari, dove i piccoli RNA agiscono come molecole di segnalazione all'interno della rete intercellulare.
Introduction
I piccoli RNA non codificanti sono importanti attori nella regolazione del gene cellulare. Queste molecole sono composte da 20-25 nucleotidi che si legano ad un specifico mRNA bersaglio, portando al blocco della traduzione o al degradazione mRNA 1 , 2 . Il processo di regolazione del gene intrapreso da piccoli RNA, come miRNA e siRNA, è un meccanismo altamente conservato che è stato trovato in molte specie diverse 3 . In particolare, le molecole di miRNA sono di cruciale importanza per una varietà di processi fisiologici, compresa la proliferazione, la differenziazione e la rigenerazione 4 , 5 . Inoltre, la disregolazione dell'espressione miRNA è attribuita a molti disturbi patologici. Correlativamente, i miRNAs sono stati dimostrati essere adatti come biomarkers per la diagnosi e come agenti terapeutici per la terapia genica 6 , 7 </sup>.
Le giunzioni di Gap (GJs) sono strutture proteiche specializzate nella membrana plasmatica di due cellule adiacenti che consentono lo scambio diffusionale di molecole con un peso molecolare fino a 1 kD. Sono stati dimostrati importanti per lo sviluppo del tessuto, la differenziazione, la morte cellulare e le patologie patologiche come il cancro o le malattie cardiovascolari 8 , 9 , 10 . Molte molecole sono state descritte come in grado di attraversare canali GJ, ioni, metaboliti e nucleotidi. È interessante notare che anche GJs hanno fornito un percorso per il movimento intercellulare di piccoli RNA 11 , 12 . Così, miRNAs possono agire non solo all'interno della cellula in cui vengono prodotte, ma anche all'interno di cellule riceventi. Ciò evidenzia il ruolo dei miRNA nel sistema di trasduzione di segnali intercellulari. Allo stesso tempo, i dati dimostranoTale interconnessione junctional intercellulare è strettamente legata alla funzione miRNA. A causa dell'impatto significativo di miRNA e GJ sull'omeostasi tissutale, la patologia e la diagnosi, una comprensione completa della funzione dei GJ e delle relative dinamiche intercellulari del miRNA contribuirà a chiarire i meccanismi delle malattie basate su miRNA e sviluppare nuove strategie per MiRNA terapie.
A seconda dell'ampiezza del giunto junctional gap, il trasferimento di molecole di miRNA tra le cellule può essere un processo molto rapido. Pertanto, è necessaria una metodologia che consente la visualizzazione e la quantificazione del rapido movimento intercellulare di queste molecole di segnalazione normativa. Comunemente, sono state applicate citometrie di flusso e tecniche molecolari biologiche per dimostrare la shuttling di piccoli RNA 11 , 12 , 13 , 14 . Tuttavia, a differenza di FRAP microsCopia, questi approcci non hanno una elevata risoluzione temporale, che è obbligatoria quando si analizza lo scambio di miRNA attraverso GJs. Inoltre, la microscopia FRAP è meno invasiva e quindi rappresenta una potente e innovativa tecnica di imaging a cellule vive per valutare lo scambio di molecole di GJ-dipendenti in diversi tipi di cellule 15 , 16 , 17 .
Qui presentiamo un protocollo dettagliato che descrive l'applicazione di 3D-FRAP per valutare il flusso di miRNA tra i cardiomiociti. A questo scopo, i cardiomiociti sono stati trasfettati con miRNA a fluorescenza. Una cellula contrassegnata con questo miRNA è stata fotoblificata e il ritorno di miRNA giunzionale differenziale dalle cellule adiacenti è stato registrato in modo dipendente dal tempo. L'elevata risoluzione temporale degli esperimenti FRAP offre la possibilità di eseguire studi cinetici per la precisa valutazione del trasferimento intercellulare di miRNA e siRNA tra le cellule viventi. MoreoVisto che i piccoli RNA possono essere scambiati attraverso meccanismi diversi con cinetica molto diverse, la microscopia FRAP può contribuire a chiarire la misura in cui i GJs sono coinvolti nei rispettivi processi di spostamento 18 . Inoltre, 3D-FRAP può essere utilizzato per indagare le alterazioni fisiologiche e patologiche della permeabilità di GJ e il suo impatto sul piccolo trasferimento di RNA 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs sono attori chiave della fisiologia cellulare e sono stati dimostrati di agire come molecole di segnalazione utilizzando, tra gli altri, GJs come percorso per lo scambio intercellulare 11 , 12 , 22 . Il protocollo attuale presenta una tecnica di imaging in vivo in vitro per caratterizzare questa shuttling dipendente dal GJ utilizzando miRNA fluorescenti all'interno dei cluster di cellule.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero Federale dell'Istruzione e della Ricerca Germania (FKZ 0312138A e FKZ 316159), lo Stato Meclemburgo-Pomerania Occidentale con i Fondi Strutturali dell'UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 e ESF / IVBM-B35-0010 / 12), il DFG (DA1296-1) e la Fondazione tedesca del cuore (F / 01/12). Inoltre, RD è supportato dal programma FORUN di Rostock University Medical Center (889001), dalla Fondazione DAMP e dal BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
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