3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi
Summary
Burada, miRNA'nın aralık bağlantısına bağımlı tomurcuk analizi için photobleaching (3D-FRAP) sonrası üç boyutlu floresan geri kazanımının uygulanmasını açıklıyoruz. Yaygın olarak uygulanan yöntemlerin aksine, 3D-FRAP, küçük RNA'ların hücreler arası transferinin gerçek zamanlı olarak, yüksek uzaysal-zamanlı çözünürlük ile nicelendirilmesini sağlar.
Abstract
MiRNA ve siRNA gibi küçük antisens RNA'lar, hücresel fizyoloji ve patolojide önemli rol oynar ve dahası, çeşitli hastalıkların tedavisinde terapötik ajanlar olarak kullanılabilir. MiRNA / siRNA tedavisi için yeni, yenilikçi stratejilerin geliştirilmesi, temel mekanizmalar hakkında kapsamlı bir bilgiye dayanmaktadır. Yeni veriler, küçük RNA'ların hücreler arasında bir boşluk bağlantısına bağlı bir şekilde değiştirildiğini ve böylece alıcı hücrede gen düzenleyici etkilere yol açtığını düşündürmektedir. Moleküler biyolojik teknikler ve akış sitometrik analizi, miRNA'nın hücrelerarası alışverişini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler moleküllerin boşluk birleşim akışını incelerken gerekli olan yüksek zamansal çözünürlüğü sağlamazlar. Dolayısıyla, miRNA / siRNA'nın hücreler arası sinyal molekülleri olarak etkisini araştırmak için, bu küçük RNA'ların hücresel seviyede analiz edilmesine izin verecek yeni araçlar gereklidir. Bu protokol, apKardiyak hücreler arasındaki miRNA moleküllerinin boşluk birleşimine bağımlı değişimini aydınlatmak için photobleaching (3D-FRAP) mikroskopisi sonrası üç boyutlu flüoresan iyileşmesinin plikasyonu. Önemlisi, bu basit ve non-invaziv canlı hücre görüntüleme yaklaşımı, yüksek zaman zamanlı çözünürlük ile gerçek zamanlı olarak floresanla işaretlenmiş küçük RNA'ların boşluk birleşimsel geçişinde görselleştirme ve miktar tayini yapılmasına olanak tanır. 3D-FRAP tarafından elde edilen veriler, küçük hücrelerin içinde hücrelere sinyal düzenleyici moleküller olarak etki eden hücreler arası gen düzenlenmesinin yeni bir yolunu teyit etmektedir.
Introduction
Küçük kodlamayan RNA'lar hücresel gen düzenlemesinde önemli oyunculardır. Bu moleküller, belirli bir hedef mRNA'ya bağlanan 20-25 nükleotidden oluşur, bu da translasyonun bloke edilmesine veya mRNA parçalanmasına yol açar 1 , 2 . MiRNA ve siRNA gibi küçük RNA'lar tarafından üstlenilen gen düzenleyici süreç, birçok farklı türde 3 bulunmuş olan oldukça korunmuş bir mekanizmadır. Özellikle miRNA molekülleri çoğalma, farklılaşma ve rejenerasyon 4 , 5 dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçler için çok önemlidir. Buna ek olarak, miRNA ekspresyonunun düzensizliği, bir çok patolojik bozukluğa atfedilir. Buna uygun olarak, miRNA'ların teşhis için biyolojik belirteç olarak ve gen terapisi için terapötik ajanlar olarak uygun olduğu gösterilmiştir 6,7 </sup>.
Boşluk kavşakları (GJs), iki bitişik hücrenin plazma zarında, 1 kD'ye kadar bir molekül ağırlığına sahip moleküllerin difüzyonel değişimini sağlayan özel protein yapılarıdır. Dokuların gelişimi, farklılaşması, hücre ölümleri ve kanser veya kardiyovasküler hastalık 8 , 9 , 10 gibi patolojik bozukluklar için önemli oldukları gösterilmiştir. Birkaç molekül, iyonlar, metabolitler ve nükleotidler de dahil olmak üzere GJ kanallarını geçebilecek nitelikte olarak tarif edilmiştir. İlginç bir şekilde, GJ'lerin küçük RNA'ların hücre içi hareketi için bir yol sağladığı 11,12 bulundu. Dolayısıyla, miRNA'lar yalnızca üretildikleri hücrede değil, aynı zamanda alıcı hücreler içinde de hareket edebilir. Bu, hücrelerarası sinyal iletim sisteminde miRNA'ların rolünü vurgular. Aynı zamanda, veriler gösterilenBu boşluk bağlantılı hücresel-iletişim, miRNA fonksiyonuyla yakından ilişkilidir. MiRNA ve GJ'lerin doku homeostazı, patoloji ve teşhis üzerindeki belirgin etkisi nedeniyle, GJ'lerin ve miRNA'nın ilgili hücre içi dinamikleri hakkında kapsamlı bir anlayış, miRNA'ya dayalı hastalıkların mekanizmalarını aydınlatmaya ve yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır. MiRNA terapileri.
Boşluk bağlantılı bağlanmanın derecesine bağlı olarak, miRNA moleküllerinin hücreler arasında aktarılması çok hızlı bir işlem olabilir. Bu nedenle, bu düzenleyici sinyal moleküllerinin hızlı hücresel hareketi görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesine izin veren bir yöntem gereklidir. Genellikle, akış sitometrisi ve moleküler biyolojik teknikler küçük RNA'ların 11 , 12 , 13 , 14'ün geçişini göstermek için uygulanmıştır. Bununla birlikte, FRAP mikrolarına karşıBu yaklaşımlar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip değildir, bu da GJs yoluyla miRNA değişimini analiz ederken zorunludur. Ayrıca, FRAP mikroskopisi daha az invazivtir ve bu nedenle birkaç hücre tipinde 15 , 16 , 17 moleküllerin GJ'ye bağlı değişimini değerlendirmek için güçlü ve yeni bir canlı hücre görüntüleme tekniğini temsil eder.
Burada, kardiyomiyositler arasındaki miRNA'yı değerlendirmek için 3D-FRAP uygulamasını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Bu amaçla kardiyomiyositlere flüoresan etiketli miRNA transfekte edildi. Bu miRNA ile işaretlenmiş bir hücre fotobleached edildi ve bitişik hücrelere ait boşluk birleşimsel miRNA re-influx'a zamana bağlı bir şekilde kaydedildi. FRAP deneylerinin yüksek zamansal çözünürlüğü, yaşayan hücreler arasında miRNA ve siRNA'nın hücreler arası transferinin hassas değerlendirilmesi için kinetik çalışmalar yapma imkanı sunar. MoreoKüçük RNA'lar farklı mekanizmalar vasıtasıyla çok farklı kinetiklerle değiştirilebildiğinden FRAP mikroskopisi, GJ'lerin ilgili kepçme süreçlerinde ne dereceye kadar yer aldığını açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir 18 . Ek olarak, 3D-FRAP, GJ geçirgenliğinde fizyolojik ve patolojik değişiklikler ve bunun küçük RNA transferi üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir 15,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAlar, hücresel fizyolojideki kilit aktörlerdir ve hücrelerarası değişim için bir yol olarak GJ'leri 11 , 12 , 22 kullanarak – diğerlerinin yanında – kullanarak sinyal molekülleri olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Mevcut protokol , hücre kümelerinde flüoresan miRNA'lar kullanarak bu GJ'ye bağımlı mekikleşmeyi karakterize etmek için bir in vitro canlı hücre görü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Federal Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (FKZ 0312138A ve FKZ 316159), AB Yapısal Fonlarıyla Devlet Mecklenburg-Batı Pomerania (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 ve ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) ve Alman Kalp Vakfı (F / 01/12). Buna ek olarak, RD, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi (889001), DAMP Vakfı ve BMBF (VIP + 00240) FORUN Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA – A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
