Analyse der Gap-Junction-abhängigen Übertragung von miRNA mit 3D-FRAP-Mikroskopie
Summary
Hier beschreiben wir die Anwendung der dreidimensionalen Fluoreszenz-Wiedergewinnung nach Photobleichung (3D-FRAP) für die Analyse des spaltübergangsabhängigen Shuttles von miRNA. Im Gegensatz zu allgemein angewandten Methoden ermöglicht 3D-FRAP die Quantifizierung der interzellulären Übertragung von kleinen RNAs in Echtzeit mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung.
Abstract
Kleine Antisense-RNAs, wie miRNA und siRNA, spielen eine wichtige Rolle in der zellulären Physiologie und Pathologie und können darüber hinaus als therapeutische Mittel bei der Behandlung mehrerer Krankheiten eingesetzt werden. Die Entwicklung neuer, innovativer Strategien für die miRNA / siRNA-Therapie basiert auf einer umfassenden Kenntnis der zugrunde liegenden Mechanismen. Jüngste Daten deuten darauf hin, dass kleine RNAs zwischen den Zellen in einer spaltübergangsabhängigen Weise ausgetauscht werden, wodurch die Genregulationseffekte in der Empfängerzelle induziert werden. Molekulare biologische Techniken und Durchflusszytometrie werden häufig verwendet, um den interzellulären Austausch von miRNA zu untersuchen. Allerdings bieten diese Methoden keine hohe zeitliche Auflösung, was notwendig ist, wenn man den lückenübergreifenden Fluss von Molekülen studiert. Um die Wirkung von miRNA / siRNA als interzelluläre Signalmoleküle zu untersuchen, sind daher neue Werkzeuge erforderlich, die die Analyse dieser kleinen RNAs auf zellulärer Ebene ermöglichen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die apPlication der dreidimensionalen Fluoreszenz-Wiedergewinnung nach Photobleichung (3D-FRAP) -Mikroskopie zur Aufklärung des spaltübergangsabhängigen Austauschs von miRNA-Molekülen zwischen Herzzellen. Wichtig ist, dass dieser unkomplizierte und nicht invasive Live-Zell-Imaging-Ansatz die Visualisierung und Quantifizierung des Lücken-Junction-Shuttles von fluoreszenzmarkierten kleinen RNAs in Echtzeit mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung ermöglicht. Die von 3D-FRAP erhaltenen Daten bestätigen einen neuartigen Weg der interzellulären Genregulation, bei dem kleine RNAs als Signalmoleküle innerhalb des interzellulären Netzwerks wirken.
Introduction
Kleine nicht-kodierende RNAs sind wichtige Akteure in der zellulären Genregulation. Diese Moleküle bestehen aus 20-25 Nukleotiden, die an eine spezifische Ziel-mRNA binden, was zu einer Blockade der Translation oder zum mRNA-Abbau 1 , 2 führt . Der Genregulationsprozess, der von kleinen RNAs wie miRNA und siRNA durchgeführt wird, ist ein hochkonservierter Mechanismus, der in vielen verschiedenen Arten gefunden wurde 3 . Insbesondere sind miRNA-Moleküle von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von physiologischen Prozessen, einschließlich Proliferation, Differenzierung und Regeneration 4 , 5 . Darüber hinaus wird die Dysregulation der miRNA-Expression vielen pathologischen Störungen zugeschrieben. Entsprechend haben sich miRNAs als Biomarker für die Diagnose und als therapeutische Mittel für die Gentherapie 6 , 7 als geeignet erwiesen </suP>.
Gap-Junctions (GJs) sind spezialisierte Proteinstrukturen in der Plasmamembran von zwei benachbarten Zellen, die den diffusionalen Austausch von Molekülen mit einem Molekulargewicht von bis zu 1 kD ermöglichen. Sie haben sich als wichtig für die Gewebeentwicklung, Differenzierung, Zelltod und pathologische Störungen wie Krebs oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen erwiesen 8 , 9 , 10 . Es wurden mehrere Moleküle beschrieben, die in der Lage sind, GJ-Kanäle zu kreuzen, einschließlich Ionen, Metaboliten und Nukleotiden. Interessanterweise wurden auch GJs einen Weg für die interzelluläre Bewegung kleiner RNAs 11 , 12 gefunden . So können miRNAs nicht nur innerhalb der Zelle wirken, in der sie produziert werden, sondern auch innerhalb der Empfängerzellen. Dies unterstreicht die Rolle von miRNAs im interzellulären Signaltransduktionssystem. Gleichzeitig zeigen die DatenDiese lückenübergreifende interzelluläre Kommunikation ist eng mit der miRNA-Funktion verknüpft. Aufgrund des signifikanten Einflusses von miRNA und GJs auf die Gewebshomöostase, Pathologie und Diagnose wird ein umfassendes Verständnis der Funktion von GJs und der damit verbundenen interzellulären Dynamik von miRNA dazu beitragen, die Mechanismen von miRNA-basierten Krankheiten zu klären und neue Strategien zu entwickeln MiRNA-Therapien
Abhängig von der Ausdehnung der Lücken-Junction-Kopplung kann die Übertragung von miRNA-Molekülen zwischen den Zellen ein sehr schneller Prozess sein. Daher ist eine Methodik erforderlich, die die Visualisierung und Quantifizierung der schnellen interzellulären Bewegung dieser regulatorischen Signalmoleküle ermöglicht. Häufig wurden Strömungszytometrie und molekularbiologische Techniken angewendet, um das Shuttling von kleinen RNAs 11 , 12 , 13 , 14 zu demonstrieren. Im Gegensatz zu FRAP microsKopie, diese Ansätze fehlen eine hohe zeitliche Auflösung, die bei der Analyse des Austauschs von miRNA über GJs obligatorisch ist. Darüber hinaus ist die FRAP-Mikroskopie weniger invasiv und stellt daher eine leistungsstarke und neuartige Live-Zell-Bildgebung dar, um den GJ-abhängigen Austausch von Molekülen in mehreren Zelltypen 15 , 16 , 17 zu bewerten.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Anwendung von 3D-FRAP beschreibt, um miRNA-Shuttling zwischen Kardiomyozyten zu beurteilen. Zu diesem Zweck wurden Kardiomyozyten mit fluoreszenzmarkierter miRNA transfiziert. Eine mit dieser miRNA markierte Zelle wurde photobleicht und der spaltübergreifende miRNA-Rückfluss aus benachbarten Zellen wurde zeitabhängig aufgezeichnet. Die hochzeitige Auflösung von FRAP-Experimenten bietet die Möglichkeit, kinetische Untersuchungen zur genauen Auswertung der interzellulären Übertragung von miRNA und siRNA zwischen lebenden Zellen durchzuführen. MehrWenn kleine RNAs über verschiedene Mechanismen mit sehr unterschiedlicher Kinetik ausgetauscht werden können, kann die FRAP-Mikroskopie helfen, zu klären, inwieweit GJs an den jeweiligen Shuttling-Prozessen beteiligt sind 18 . Darüber hinaus kann 3D-FRAP verwendet werden, um physiologische und pathologische Veränderungen in der GJ-Permeabilität und deren Auswirkungen auf den kleinen RNA-Transfer zu untersuchen 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs sind Schlüsselakteure in der zellulären Physiologie und wurden als Signalmoleküle bezeichnet, indem sie unter anderem – GJs als Weg für den interzellulären Austausch 11 , 12 , 22 – verwendet wurden . Das aktuelle Protokoll stellt eine in vitro- Live-Zell-Bildgebung dar, um dieses GJ-abhängige Shuttling unter Verwendung fluoreszierender miRNAs innerhalb von Zellclustern zu charakterisieren….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A und FKZ 316159), dem Staat Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 und ESF / IVBM-B35-0010 / 12), die DFG (DA1296-1) und die Deutsche Herzstiftung (F / 01/12). Darüber hinaus wird RD durch das FORUN-Programm des Rostock University Medical Centers (889001), der DAMP Foundation und des BMBF (VIP + 00240) unterstützt.
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
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