Анализ зависимой от разрыва связи переноса miRNA с помощью 3D-FRAP-микроскопии
Summary
Здесь мы описываем применение трехмерного восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (3D-FRAP) для анализа зависимого от щелевого перехода челнока miRNA. В отличие от общепринятых методов, 3D-FRAP позволяет количественно определять межклеточный перенос малых РНК в реальном времени с высоким пространственно-временным разрешением.
Abstract
Малые антисмысловые РНК, такие как miRNA и siRNA, играют важную роль в клеточной физиологии и патологии и, более того, могут быть использованы в качестве терапевтических агентов для лечения нескольких заболеваний. Разработка новых инновационных стратегий терапии miRNA / siRNA основана на обширном знании основных механизмов. Недавние данные свидетельствуют о том, что небольшие РНК обмениваются между клетками в зависимом от щелевого соединения образом, тем самым индуцируя регуляторные эффекты гена в клетке-реципиенте. Молекулярно-биологические методы и проточный цитометрический анализ обычно используются для изучения межклеточного обмена miRNA. Однако эти методы не обеспечивают высокого временного разрешения, что необходимо при изучении щелевого взаимодействия молекул. Поэтому для исследования влияния miRNA / siRNA в качестве межклеточных сигнальных молекул необходимы новые инструменты, которые позволят проанализировать эти небольшие РНК на клеточном уровне. В настоящем протоколе описывается ap(3D-FRAP) микроскопии для выяснения взаимозависимого обмена молекул miRNA между сердечными клетками. Важно отметить, что этот простой и неинвазивный подход к визуализации живых клеток позволяет визуализировать и количественно измерять щелевую синхронизацию флуоресцентно меченных малых РНК в реальном времени с высоким пространственно-временным разрешением. Данные, полученные 3D-FRAP, подтверждают новый путь регуляции межклеточного гена, где небольшие РНК действуют как сигнальные молекулы внутри межклеточной сети.
Introduction
Малые некодирующие РНК являются важными игроками в регуляции клеточных генов. Эти молекулы состоят из 20-25 нуклеотидов, которые связываются с специфической мишенью-мРНК, что приводит к блокировке трансляции или деградации мРНК 1 , 2 . Процесс регуляции генов, осуществляемый малыми РНК, такими как miRNA и siRNA, является высококонсервативным механизмом, который был обнаружен у многих разных видов 3 . В частности, молекулы miRNA имеют решающее значение для различных физиологических процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и регенерацию 4 , 5 . Кроме того, дисрегуляция экспрессии miRNA объясняется многими патологическими нарушениями. Соответственно, miRNAs были признаны пригодными в качестве биомаркеров для диагностики и в качестве терапевтических агентов для генной терапии 6 , 7 </suр>.
Разрывные соединения (GJ) являются специализированными белковыми структурами в плазматической мембране двух смежных клеток, которые позволяют диффузионный обмен молекулами с молекулярной массой до 1 кД. Было показано, что они важны для развития тканей, дифференцировки, гибели клеток и патологических нарушений, таких как рак или сердечно-сосудистые заболевания 8 , 9 , 10 . Несколько молекул описаны как способные пересекать GJ-каналы, включая ионы, метаболиты и нуклеотиды. Интересно, что ГД также были найдены, чтобы обеспечить путь для межклеточного движения малых РНК 11 , 12 . Таким образом, miRNAs могут действовать не только внутри клетки, в которой они производятся, но также и внутри клеток-реципиентов. Это подчеркивает роль miRNAs в межклеточной системе трансдукции сигнала. В то же время данные демонстрируютЭта щелевая межклеточная связь тесно связана с функцией miRNA. Из-за значительного воздействия miRNA и GJ на гомеостаз, патологию и диагностику тканей, всестороннее понимание функции GJs и связанной с ними межклеточной динамики miRNA поможет прояснить механизмы заболеваний, основанных на miRNA, и разработать новые стратегии для MiRNA-терапии.
В зависимости от степени щелевого взаимодействия, передача молекул miRNA между клетками может быть очень быстрым процессом. Поэтому требуется методология, позволяющая визуализировать и количественно определять быстрое межклеточное перемещение этих регулирующих сигнальных молекул. Как правило, проточная цитометрия и молекулярно-биологические методы были применены для демонстрации челночного движения небольших РНК 11 , 12 , 13 , 14 . Однако, в отличие от микроскопов FRAPКопии, эти подходы не имеют высокого временного разрешения, что является обязательным при анализе обмена miRNA через GJs. Кроме того, микроскопия FRAP менее инвазивна и поэтому представляет собой мощный и новый метод визуализации живых клеток для оценки GJ-зависимого обмена молекулами в нескольких типах клеток 15 , 16 , 17 .
Здесь мы приводим подробный протокол, описывающий применение 3D-FRAP для оценки транскрипции miRNA между кардиомиоцитами. С этой целью кардиомиоциты трансфицировали флуоресцентно меченной миРНК. Клетка, отмеченная этой miRNA, была фотоэлементами, и повторный приток межклеточной миРНК из смежных клеток регистрировался зависящим от времени образом. Высокое временное разрешение экспериментов FRAP дает возможность проводить кинетические исследования для точной оценки межклеточного переноса miRNA и siRNA между живыми клетками. MoreoVer, так как небольшие РНК могут быть обменены с помощью разных механизмов с сильно различной кинетикой, FRAP-микроскопия может помочь выяснить, в какой степени ГД участвуют в соответствующих процессах челночного процесса. Кроме того, 3D-FRAP можно использовать для исследования физиологических и патологических изменений проницаемости GJ и его влияния на перенос малых РНК 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs являются ключевыми игроками в клеточной физиологии и, как было показано, действуют как сигнальные молекулы, используя, среди прочего, GJ как путь межклеточного обмена 11 , 12 , 22 . Текущий протокол представляет собой метод визуализа?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и исследований Германии (FKZ 0312138A и FKZ 316159), Государственным Мекленбург-Передняя Померания с Структурными фондами ЕС (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 и ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) и Германский сердечный фонд (F / 01/12). Кроме того, RD поддерживается Программой FORUN Медицинского центра Университета Ростока (889001), Фонда DAMP и BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA – A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
