Analyse af Gap Junction-afhængig Overførsel af miRNA med 3D-FRAP Microscopy
Summary
Her beskriver vi anvendelsen af tredimensionel fluorescensgenvinding efter photobleaching (3D-FRAP) til analysen af den mellemrumsafhængige pendling af miRNA. I modsætning til almindeligt anvendte metoder tillader 3D-FRAP kvantificering af den intercellulære overførsel af små RNA'er i realtid med høj spatio-temporal opløsning.
Abstract
Små antisense-RNA'er, som miRNA og siRNA, spiller en vigtig rolle i cellulær fysiologi og patologi og kan desuden anvendes som terapeutiske midler til behandling af flere sygdomme. Udviklingen af nye, innovative strategier for miRNA / siRNA-terapi er baseret på en omfattende viden om de underliggende mekanismer. Nylige data tyder på, at små RNA'er udveksles mellem celler på en gabsforbindelsesafhængig måde og derved inducerer genregulerende virkninger i recipientcellen. Molekylærbiologiske teknikker og flowcytometrisk analyse anvendes almindeligt til at studere intercellulær udveksling af miRNA. Imidlertid tilvejebringer disse metoder ikke høj tidsmæssig opløsning, hvilket er nødvendigt, når man studerer gab-forbindelsesfluxet af molekyler. Derfor, for at undersøge virkningen af miRNA / siRNA som intercellulære signalmolekyler, er der brug for nye værktøjer, som vil muliggøre analysen af disse små RNA'er på cellulært niveau. Den foreliggende protokol beskriver apPlication af tredimensionel fluorescensgenvinding efter photobleaching (3D-FRAP) mikroskopi for at belyse kløften forbindelsesafhængig udveksling af miRNA molekyler mellem hjerteceller. Det er vigtigt, at denne ligefremme og ikke-invasive levendecellebilledfremgangsmåde gør det muligt at visualisere og kvantificere mellemrumskrydsningen af fluorescensmærkede små RNA'er i realtid med høj spatio-temporal opløsning. Dataene opnået ved 3D-FRAP bekræfter en ny vej af intercellulær genregulering, hvor små RNA'er virker som signalmolekyler inden for det intercellulære netværk.
Introduction
Små ikke-kodende RNA'er er vigtige aktører inden for cellegeneregulering. Disse molekyler er sammensat af 20-25 nukleotider, som binder til et specifikt mål-mRNA, hvilket fører til blokering af translation eller til mRNA-nedbrydning 1 , 2 . Genreguleringsprocessen, der gennemføres af små RNA'er, såsom miRNA og siRNA, er en stærkt bevaret mekanisme, som er blevet fundet i mange forskellige arter 3 . Især miRNA-molekyler er af afgørende betydning for en række fysiologiske processer, herunder proliferation, differentiering og regenerering 4 , 5 . Derudover tilskrives dysreguleringen af miRNA-ekspression mange patologiske lidelser. Tilsvarende har miRNA'er vist sig at være egnet som biomarkører til diagnose og som terapeutiske midler til genterapi 6 , 7 </sup>.
Gap junctions (GJs) er specialiserede proteinkonstruktioner i plasmamembranen af to tilstødende celler, der tillader diffusionsudveksling af molekyler med en molekylvægt på op til 1 kD. De har vist sig at være vigtige for vævsudvikling, differentiering, celledød og patologiske lidelser såsom cancer eller kardiovaskulær sygdom 8 , 9 , 10 . Flere molekyler er blevet beskrevet som værende i stand til at krydse GJ-kanaler, herunder ioner, metabolitter og nukleotider. Interessant blev GJs også fundet at tilvejebringe en vej til den intercellulære bevægelse af små RNA'er 11 , 12 . Således kan miRNA'er virke ikke kun inden for cellen, hvori de fremstilles, men også inden for modtagerceller. Dette fremhæver rollen som miRNA'er i det intercellulære signaltransduktionssystem. Samtidig viser dataeneAt den mellemliggende intercellulære kommunikation mellem kløften er tæt forbundet med miRNA-funktionen. På grund af den betydelige virkning af miRNA og GJ på vævshomostase, patologi og diagnose vil en omfattende forståelse af GJs funktion og den relaterede intercellulære dynamik i miRNA bidrage til at klarlægge mekanismerne for miRNA-baserede sygdomme og udvikle nye strategier for MiRNA terapier.
Afhængig af omfanget af mellemrumskobling kan overførslen af miRNA-molekyler mellem celler være en meget hurtig proces. Derfor kræves en metode, der muliggør visualisering og kvantificering af den hurtige intercellulære bevægelse af disse regulatoriske signalmolekyler. Almindeligvis er flowcytometri og molekylærbiologiske teknikker blevet anvendt til at demonstrere shuttling af små RNA'er 11 , 12 , 13 , 14 . Men i modsætning til FRAP-mikroberKopi, disse tilgange mangler høj tidsmæssig opløsning, hvilket er obligatorisk, når man analyserer udvekslingen af miRNA via GJs. Desuden er FRAP-mikroskopi mindre invasiv og repræsenterer derfor en kraftfuld og ny live-cellebilledteknik til at evaluere den GJ-afhængige molekylveksling i flere celletyper 15 , 16 , 17 .
Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der beskriver anvendelsen af 3D-FRAP for at vurdere miRNA shuttling mellem cardiomyocytter. Til dette formål blev kardiomyocytter transficeret med fluorescensmærkede miRNA. En celle mærket med denne miRNA blev photobleached, og gap-forbindelses-miRNA-tilstrømningen fra tilstødende celler blev registreret på en tidsafhængig måde. Den høje temporale opløsning af FRAP-eksperimenter giver mulighed for at udføre kinetiske undersøgelser for den præcise evaluering af den intercellulære overførsel af miRNA og siRNA mellem levende celler. MoreoEftersom små RNA'er kan udveksles via forskellige mekanismer med meget forskellig kinetik, kan FRAP-mikroskopi bidrage til at præcisere, i hvilket omfang GJ'er er involveret i de respektive shuttling-processer 18 . Derudover kan 3D-FRAP bruges til at undersøge fysiologiske og patologiske ændringer i GJ-permeabilitet og dens indvirkning på små RNA-overførsler 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNA'er er nøgleaktører i cellulær fysiologi og blev vist til at fungere som signalmolekyler ved at anvende-blandt andet -GJ'er som en vej for intercellulær udveksling 11 , 12 , 22 . Den nuværende protokol præsenterer en in vitro levende cellebilledteknik for at karakterisere denne GJ-afhængige pendling ved anvendelse af fluorescerende miRNA'er i celleklynger.
Prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning Tyskland (FKZ 0312138A og FKZ 316159), staten Mecklenburg-Vorpommern med EU's strukturfonde (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 og ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), og German Heart Foundation (F / 01/12). Desuden understøttes RD af FORUN-programmet fra Rostock University Medical Center (889001), DAMP Foundation og BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA – A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
