Analyse av Gap Junction-avhengig Overføring av miRNA med 3D-FRAP Mikroskopi
Summary
Her beskriver vi anvendelsen av tredimensjonal fluorescensgjenoppretting etter photobleaching (3D-FRAP) for analysen av gapforbindelsesavhengig shuttling av miRNA. I motsetning til vanlige anvendte metoder, tillater 3D-FRAP kvantifisering av intercellulær overføring av små RNA i sanntid, med høy spatio-temporal oppløsning.
Abstract
Små antisense-RNAer, som miRNA og siRNA, spiller en viktig rolle i cellulær fysiologi og patologi, og kan dessuten brukes som terapeutiske midler ved behandling av flere sykdommer. Utviklingen av nye, innovative strategier for miRNA / siRNA-terapi er basert på omfattende kunnskap om de underliggende mekanismer. Nylige data antyder at små RNAer utveksles mellom celler i en gapsknapsavhengig måte, og derved fremkaller genregulerende effekter i mottakercellen. Molekylærbiologiske teknikker og strømningscytometrisk analyse brukes ofte til å studere intercellulær utveksling av miRNA. Imidlertid gir disse metodene ikke høy tidsmessig oppløsning, noe som er nødvendig når man studerer gapforbindelsesflommen av molekyler. Derfor, for å undersøke virkningen av miRNA / siRNA som intercellulære signalmolekyler, er det behov for nye verktøy som vil tillate analyse av disse små RNAene på mobilnivå. Den nåværende protokollen beskriver apPlication av tredimensjonal fluorescensgjenoppretting etter photobleaching (3D-FRAP) mikroskopi for å belyse gapet avstandsavhengig utveksling av miRNA-molekyler mellom hjerteceller. Viktig er at denne enkle og ikke-invasive levendecellebildingsmetoden tillater visualisering og kvantifisering av gapforbindelsesskjutingen av fluorescensmerkede små RNA i sanntid, med høy spatio-temporal oppløsning. Dataene som er oppnådd ved hjelp av 3D-FRAP, bekrefter en ny fremgangsmåte for intercellulær genregulering, hvor små RNA'er fungerer som signalmolekyler i det intercellulære nettverket.
Introduction
Små ikke-kodende RNA er viktige aktører innen cellegeneregulering. Disse molekylene er sammensatt av 20-25 nukleotider som binder til et bestemt målmRNA, som fører til blokkering av oversettelse eller til mRNA-nedbrytning 1 , 2 . Genreguleringsprosessen som utføres av små RNA, som miRNA og siRNA, er en svært konsentrert mekanisme som har blitt funnet i mange forskjellige arter 3 . Spesielt er miRNA-molekyler av avgjørende betydning for en rekke fysiologiske prosesser, inkludert spredning, differensiering og regenerering 4 , 5 . I tillegg tilskrives dysreguleringen av miRNA-ekspresjon til mange patologiske forstyrrelser. Tilsvarende har miRNAer blitt vist å være egnet som biomarkører for diagnose og som terapeutiske midler for genterapi 6 , 7 </sup>.
Gap junctions (GJ) er spesialiserte proteinkonstruksjoner i plasmamembranen til to tilstøtende celler som tillater diffusjonsutveksling av molekyler med en molekylvekt på opptil 1 kD. De har vist seg å være viktige for vevsutvikling, differensiering, celledød og patologiske forstyrrelser som kreft eller kardiovaskulær sykdom 8 , 9 , 10 . Flere molekyler er blitt beskrevet som værende i stand til å krysse GJ-kanaler, inkludert ioner, metabolitter og nukleotider. Interessant, ble også GJs funnet å gi en vei for intercellulær bevegelse av små RNAer 11 , 12 . Dermed kan miRNAs ikke bare fungere i cellen der de er produsert, men også innenfor mottakerceller. Dette fremhever rollen som miRNAer i det intercellulære signaltransduksjonssystemet. Samtidig viser dataeneAt gapet mellomliggende intercellulær kommunikasjon er nært knyttet til miRNA-funksjonen. På grunn av den betydelige effekten av miRNA og GJ på vevshemostase, patologi og diagnose, vil en omfattende forståelse av GJs funksjon og den relaterte intercellulære dynamikken til miRNA bidra til å avklare mekanismene til miRNA-baserte sykdommer og utvikle nye strategier for MiRNA terapier.
Avhengig av omfanget av gapforbindelseskoblingen kan overføringen av miRNA-molekyler mellom celler være en meget rask prosess. Derfor kreves en metodikk som tillater visualisering og kvantifisering av den hurtige intercellulære bevegelsen av disse regulatoriske signalmolekylene. Vanligvis har strømningscytometri og molekylærbiologiske teknikker blitt anvendt for å demonstrere shuttling av små RNAer 11 , 12 , 13 , 14 . Imidlertid, i motsetning til FRAP-mikroberKopi, disse tilnærmingene mangler høy temporal oppløsning, som er obligatorisk når man analyserer utveksling av miRNA via GJs. Videre er FRAP-mikroskopi mindre invasiv og representerer derfor en kraftig og ny levende cellediagnostikkteknikk for å evaluere den GJ-avhengige molekylutvekslingen i flere celletyper 15 , 16 , 17 .
Her presenterer vi en detaljert protokoll som beskriver anvendelsen av 3D-FRAP for å vurdere miRNA shuttling mellom kardiomyocytter. For dette formål ble kardiomyocytter transfektert med fluorescensmerket miRNA. En celle merket med denne miRNA ble photobleached, og gap-junctional miRNA re-tilstrømning fra tilstøtende celler ble registrert på en tidsavhengig måte. Den høye temporale oppløsningen av FRAP-eksperimenter gir muligheten til å utføre kinetiske studier for den nøyaktige evalueringen av intercellulær overføring av miRNA og siRNA mellom levende celler. MoreoVer, da små RNAer kan utveksles via forskjellige mekanismer med svært forskjellig kinetikk, kan FRAP-mikroskopi bidra til å avklare i hvilken grad GJ er involvert i respektive shuttling-prosesser 18 . I tillegg kan 3D-FRAP brukes til å undersøke fysiologiske og patologiske endringer i GJ-permeabilitet og dens innvirkning på liten RNA-overføring 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs er sentrale aktører i cellefysiologi og ble vist å fungere som signalmolekyler ved å bruke-blant annet -GJs som en vei for intercellulær utveksling 11 , 12 , 22 . Den nåværende protokollen presenterer en in vitro levendecellebildeteknikk for å karakterisere denne GJ-avhengige shuttling ved bruk av fluorescerende miRNAer i celleklynger.
Protokollen ble utviklet på kardio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Forbundsdepartementet for utdanning og forskning Tyskland (FKZ 0312138A og FKZ 316159), staten Mecklenburg-Vorpommern med EUs strukturfond (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 og ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), og German Heart Foundation (F / 01/12). I tillegg støttes RD av FORUN-programmet til Rostock University Medical Center (889001), DAMP Foundation, og BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA – A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
