الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة
Summary
هذه المخطوطة وصف أسلوب لتصور وتحديد الأحداث الترجمة المترجمة في المقصورات سوبسيلولار. يتطلب نظام تصوير [كنفوكل] أساسية والمواد الكاشفة النهج المقترح في هذه المخطوطة وهي سريعة وفعالة من حيث التكلفة.
Abstract
الآليات التي تنظم الترجمة مرناً وتشارك في مختلف العمليات البيولوجية، مثل جرثومة خط التنمية وتمايز الخلايا وأورجانوجينيسيس، وكذلك في العديد من الأمراض. وقد أظهرت العديد من المنشورات مقنع أن آليات محددة تنظم أحكام الترجمة مرناً. زيادة الاهتمام بتنظيم تعبير البروتينات المستحثة بالترجمة أدى إلى استحداث طرق جديدة لدراسة ومتابعة حيثياته البروتين التوليف في سيلولو. ومع ذلك، معظم هذه الأساليب معقدة ويجعلها مكلفة وكثيراً ما يحد من عدد أهداف مرناً التي يمكن دراستها. وتقترح هذه المخطوطة أسلوب الذي يتطلب فقط الكواشف الأساسية ونظام تصوير الأسفار [كنفوكل] قياس ووضع تصور للتغيرات التي تحدث في أي خط الخلية تحت ظروف مختلفة في الترجمة مرناً. واستخدمت هذا الأسلوب مؤخرا لإظهار الترجمة المترجمة في الهياكل سوبسيلولار الخلايا ملتصقة على مدى فترة قصيرة من الوقت، مما يتيح إمكانية تصور الترجمة حيثياته لفترة قصيرة من خلال مجموعة متنوعة من البيولوجية العمليات أو التحقق من صحة التغييرات في النشاط متعدية الجنسيات في الاستجابة للمحفزات محددة.
Introduction
تنظيم الترجمة بمختلف الوظائف الخلوية ودفعت العديد من فرق البحث لتطوير أدوات جديدة وأساليب لتحديد التعريب سوبسيلولار الترجمة مرناً وتنظم البروتين التوليف1،2 ،،من34. تسمح هذه التطورات التكنولوجية الحديثة لتحسين فهم الآليات التي تنطوي على أوبريجولاتيون الترجمة أو قمع مرناس محددة خلال العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث5 6، ،،من78. ومع ذلك، تتطلب معظم هذه الطرق مكلفة أو الخطرة والمواد الكيميائية ومعدات معينة قد لا تكون متاحة لمعظم المختبرات. على هذا النحو، قد وضعت طريقة فعالة من حيث التكلفة للسماح للتقييم السريع للأحداث الترجمة للتحايل على وجه التحديد هذه القضايا المحتملة. هذا الأسلوب يكشف التحويرات متعدية الحادة التي تحدث أثناء العمليات الخلوية المحددة ويسمح أيضا لإضفاء الطابع المحلي على الترجمة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
واستخدمت الأساليب الموصوفة هنا لرصد الترجمة المترجمة داخل مقصورات سوبسيلولار تسمى الشروع في نشر مراكز (SIC)5. سيكس هي عابرة الهياكل الموجودة في خلايا المصنف التي يتم ترجمتها على رأس المجمعات التصاق الوليدة. رغم سايكس ومجمعات التصاق متميزة، ترتبط ارتباطاً وثيقا مصائرهم. وفي الواقع، معروفة سايكس تختفي تدريجيا عند نضوج التصاق المحورية المعقدة إلى موقع التصاق خلال المرحلة الأولية للالتصاق. وجدنا أن الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات المعروفة للسيطرة على وجه التحديد مرناً الترجمة (مثلاً، Sam68، فمرب، و G3BP1) وبوليادينيلاتيد وقد أثري الكشف داخل هذه الهياكل5. باستخدام الأساليب الموضحة هنا، أظهرنا أن تنظيم مرناً SIC المرتبطة بمثابة الترجمة السماح بتفتيش المصنف الخلايا توطيد التصاق الخلية. ويمكن اعتبار هذا الأسلوب، استناداً إلى التأسيس بوروميسين، صيغة معدلة للاستشعار السطحية للمقايسة الترجمة (غروب الشمس). وضعت أصلاً لقياس معدلات توليف البروتين العالمية باستخدام الأحماض الأمينية مسماة غير إشعاعيا، بوروميسيليشن البروتين يوفر طريقة فعالة لتصور حيثياته البروتين التوليف9. يعتمد هذا الأسلوب على السلوك الجوهرية من بوروميسين، مضاد كتل الترجمة عن طريق إنهاء سلسلة سابقة لأوانها في الريبوسوم10. وفي الواقع، بوروميسين يماثل هيكلياً تيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال، يسمح لإدماجها في سلاسل ببتيد عبر تشكيل السندات ببتيد التمطيط. بيد بوروميسين ملزم لسلسلة ببتيد متزايد يمنع سندات ببتيد جديدة يجري تشكيلها بالقادم أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال، منذ بوروميسين سندات غير هيدروليسابل أميد بدلاً من السندات إستر هيدروليسابل وجدت في ترنس. وهكذا يؤدي إدماج بوروميسين في التمطيط البروتينية في إصدار سابق لأوانه عديدة بوروميسيلاتيد مبتوراً البروتينية المقابلة لترجمتها بنشاط مرناً9،11،12 .
باستخدام هذا الأسلوب، كان من الممكن لتقييم الترجمة النشطة خلال وقت قصير أرملة (مثلاً 5 دقائق) خلال الالتصاق الخلوي استخدام جسم محددة موجهة ضد بوروميسين في الخلايا التي استكملت بالمضادات الحيوية لفترات 5-دقيقة في نقاط زمنية مختلفة خلال عملية التصاق الخلية5. دقة هذا الفحص يعتمد على أجسام مضادة محددة للغاية الموجهة ضد مجموعة بوروميسيلاتيد. ويوفر اكتشاف ببتيد بوروميسيلاتيد إيممونوفلوريسسينت إعادة تقسيم سوبسيلولار عامة مرناً المترجمة حديثا، التي يمكن قياسها كمياً بدقة كبيرة باستخدام نظم التصوير [كنفوكل] أيضا.
ومن ثم، يقدم هذا الأسلوب خيار المناسب لعدد كبير من المختبرات التي تدرس آليات تنظيمية متعدية الجنسيات المشاركة في العمليات مثل تحبيب العصبية6،،من1314، 15ومورفوجين مرناً التعريب والترجمة خلال التنمية16،17. وأيضا مناسب تماما لدراسة الترجمة المترجمة أو المجزأة أثناء الأحداث البيولوجية السريعة، مثل الهجرة الخلية أو الالتصاق أو الغزو، أو لمجرد تقييم العلاج بالعقاقير التي قد تسبب التغييرات متعدية5، 7 , 18-وعموما، يسمح هذا الأسلوب لتصور الأحداث الترجمة المترجمة أو التي تسيطر عليها بطريقة سريعة ودقيقة وفعالة من حيث التكلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأتاحت التطورات التكنولوجية الحديثة لفهم أفضل لآليات المشاركة في upregulation متعدية الجنسيات أو قمع مرناس محددة في العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث. منهجية فعالة من حيث التكلفة الموضحة هنا يسمح لترجمة الأحداث تصور في الخلايا لدراسة كيف البروتينات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور رشيد المزروعي (جامعة لافال، كيبيك، كندا) لقراءة نقدية من المخطوطة. ونحن نشكر “وحدة التصوير الخلية” التابعة لمركز البحوث الخاصة بالمساعدة التقنية. هوت م. É. هو أحد علماء البحوث 1 جونيور دي فوندز بحوث دو كيبيك والصحة (فرق-S). هذا العمل كان يدعمها “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” (منح عدد استوفوا، 286437 اجتماع الأطراف أن É م. هوت).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
