Summary
Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.
Abstract
De mechanismen tot regeling van mRNA vertaling zijn betrokken in verschillende biologische processen, zoals kiem lijn ontwikkeling, celdifferentiatie en organogenese, evenals in meerdere ziekten. Talrijke publicaties hebben overtuigend aangetoond dat de specifieke mechanismen strak mRNA vertaling regelen. Toegenomen belangstelling voor de vertaling-geïnduceerde regulering van eiwit expressie heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe methoden om te bestuderen en volgen DOVO eiwit synthese in gnudles. Meeste van deze methoden zijn echter complex, waardoor ze duur en vaak een beperkt aantal mRNA doelen die kunnen worden bestudeerd. Dit manuscript wordt voorgesteld een methode waarvoor alleen eenvoudige reagentia en een confocal fluorescentie imaging systeem om te meten en visualiseren van de veranderingen in vertaling van mRNA die op een willekeurige cellijn onder verschillende omstandigheden optreden. Deze methode werd onlangs gebruikt om te laten zien van gelokaliseerde vertaling in de subcellular structuren van Adherente cellen over een korte periode van tijd, waardoor de mogelijkheid van het visualiseren van DOVO vertaling voor een korte periode tijdens een verscheidenheid van biologische processen of wijzigingen in translationeel activiteit in reactie op specifieke stimuli te valideren.
Introduction
De regulering van de vertaling door verschillende cellulaire functies heeft ertoe geleid dat vele onderzoeksteams te ontwikkelen van nieuwe instrumenten en methoden voor de bepaling van de subcellular localisatie van mRNA vertaling en gereglementeerde eiwit synthese1,2 ,3,4. Deze recente technologische vooruitgang zorgen voor een beter begrip van de mechanismen met betrekking tot vertaling opregulatie of de onderdrukking van specifieke mRNAs tijdens biologische processen, zoals de neuronale ontwikkeling, drug reactie en metastase5 ,6,7,8. Echter, de meeste van deze methoden vereist duur of gevaarlijke reagentia en specifieke apparatuur die mogelijk niet beschikbaar voor de meeste laboratoria. Als zodanig, werd een voordelige methode te voorzien in de snelle evaluatie van vertaling gebeurtenissen ontwikkeld om deze potentiële problemen specifiek te omzeilen. Deze methode detecteert acute translationeel modulaties die zich tijdens specifieke cellulaire processen voordoen en voorziet ook in de lokalisatie van de vertaling met behulp van de confocal microscopie.
De hier beschreven methoden werden gebruikt om te controleren van gelokaliseerde vertaling binnen subcellular compartimenten genaamd verspreiden initiatie centra (SIC)5. SICs zijn tijdelijke structuren gevonden in geplaatste cellen, die zijn gelokaliseerd op de top van ontluikende hechting complexen. Hoewel SICs en hechting complexen onderscheiden worden, zijn hun lot nauw verbonden. Inderdaad, SICs is bekend dat het geleidelijk aan verdwijnen op focal hechting complexe rijping in een hechting site tijdens de eerste fase van de hechting. We vonden dat RNA-bindende proteïnen bekend om specifiek mRNA vertaling (b.v., Sam68, FMRP en G3BP1) en polyadenylated RNAs werden verrijkt binnen deze structuren5. Met behulp van de methoden beschreven hier toonden wij dat de regulering van SIC-geassocieerde mRNA vertaling als een controlepunt waardoor fungeert zaadjes cellen wilt samenvoegen cel adhesie. Deze methode, op basis van puromycin de opneming, kan worden overwogen een aangepaste versie van de oppervlakte sensing van vertaling assay (zonsondergang). Oorspronkelijk ontwikkeld voor het meten van globale eiwit synthese tarieven met behulp van een niet-radioactief gelabelde aminozuur, biedt eiwit puromycilation een efficiënte manier te visualiseren van DOVO eiwit synthese9. Deze methode is gebaseerd op de intrinsieke werking van puromycin, een antibioticum dat vertaling door voortijdige keten beëindiging in de ribosome10 blokkeert. Inderdaad, puromycin is structureel analoog aan tyrosyl-tRNA, die voorziet in de opneming in het grondvlak van de peptide ketens via de vorming van een peptide-bond. Puromycin binding aan een groeiende peptide keten voorkomt echter dat een nieuwe peptide bond ontstaat met de volgende aminoacyl-tRNA, aangezien puromycin een niet-hydrolyseerbaar amide-binding in plaats van de hydrolyseerbaar ester-binding in tRNAs gevonden heeft. Dus, de opneming van puromycin in het grondvlak polypeptiden resulteert in de voortijdige vrijlating van talrijke afgeknotte puromycilated polypeptiden overeenkomt met actief vertaalde mRNA9,11,12 .
Met behulp van deze methode, was het mogelijk om binnen een korte tijd weduwe actieve vertaling beoordelen (bijvoorbeeld 5 min) tijdens de cellulaire hechting met behulp van een specifiek antilichaam gericht tegen puromycin op cellen die werden aangevuld met het antibioticum voor periodes van 5-min verwerken op verschillende tijdstippen tijdens de cel adhesie5. De nauwkeurigheid van deze test is gebaseerd op zeer specifieke antilichamen gericht tegen de groep van de puromycilated. Immunefluorescentie detectie van de puromycilated-polypeptide biedt een algemene subcellular verdeling van de nieuwe vertaalde mRNA, die ook kan worden gekwantificeerd met grote nauwkeurigheid met behulp van de confocal imaging systemen.
Vandaar, deze methode biedt tevens een relevante optie voor een groot aantal laboratoria studeren translationeel regulerende mechanismen betrokken bij processen zoals neuronale granulatie6,13,14, 15, morphogen mRNA lokalisatie en vertaling tijdens ontwikkeling16,17. Het is ook zeer geschikt voor het bestuderen van gelokaliseerde of verzuilde vertaling tijdens snelle biologische gebeurtenissen, zoals cel migratie, hechting, of invasie, of gewoon beoordelen drug behandelingen die vertalende wijzigingen5, induceren kunnen 7 , 18. over het algemeen met deze methode kan voor de visualisatie van gelokaliseerde of gecontroleerde vertaling gebeurtenissen in een snelle, nauwkeurige en kosteneffectieve manier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bepaling van de voorwaarden van de Puromycilation
Opmerking: deze techniek wordt de methode gebruikt voor het beoordelen van gelokaliseerde vertaling tijdens het MRC-5 cel adhesie proces 5 beschreven. Als puromycilation kan worden gedaan in een willekeurige cel, is het belangrijk om het optimaliseren van de puromycilation voorwaarden voor de specifieke cellijnen worden gebruikt, omdat de behandeling voorwaarden niet identiek zijn voor elke regel van de cel in termen van de concentratie van de puromycin en de gewenste zijn incubatietijd. Om te laten zien hoe deze voorwaarden worden gedefinieerd, drie cellijnen van de voorbeeld (d.w.z., HeLa, MRC-5 en Huh-7) werden behandeld met toenemende concentraties van puromycin voor verschillende incubatie tijden ( Figuur 1).
De identieke getallen- groeien van cellen in een 24-well plaat in 0,5 mL van de passende voltooien kweekmedium 16 h vóór de proef. Zaad 30.000 MRC-5 cellen, 50.000 HeLa cellen of 50.000 HuH-7 cellen per putje. Zorg ervoor om te voorkomen dat meer dan 60-70% samenvloeiing (figuur 1A).
- Voorbereiden 6 buizen met volledige cel 1,5 mL gestolde voedingsbodem met toenemende concentraties van puromycin (0, 5, 10, 15, 20 en 30 µg/mL). Vooraf warm bij 37 ° C.
- Voor elke concentratie van puromycin medium (bereid in stap 1.2), overdracht van 0,5 mL van buisvideo in 6 nieuwe buizen elk en cycloheximide op een eindconcentratie van 50 µg/mL toevoegen aan alle 6 nieuwe buizen. Vooraf warm bij 37 ° C.
- Wijzigen het medium met 0,5 mL van volledige voedingsbodem (rij 1 en 2). Voor de derde rij, Voeg 0,5 mL van volledige kweekmedium aangevuld met 50 µg/mL cycloheximide ( figuur 1B).
Opmerking: Cycloheximide behandeling is opgezet als de beste negatieve controle voor eiwit puromycilation vanwege zijn vermogen om te blokkeren vertaling rek. Omdat puromycin integratie vertaling rek vereist, cycloheximide behandeling leidt tot een verlies van puromycilated eiwit signalen 5 , 18. - Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C (5% CO 2).
- Voeg 0,5 mL van het puromycin medium bereid in stap 1.2 aan de tweede rij te verkrijgen van de eindconcentraties van 0, 2.5, 5, 7.5, 10, en 15 µg/mL, respectievelijk in de kolommen A, B, C, D, E en F. Op hetzelfde moment, 0,5 mL puromycin toevoegen aan het medium cycloheximide-aangevuld (stap 1.3) in de derde rij ( Figuur 1 c).
- Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C (5% CO 2).
- Voeg 0,5 mL van het puromycin medium bereid in stap 1.2 aan de eerste rij te verkrijgen van de eindconcentraties van 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10, en 15 µg Mo/mL ( Figuur 1 c).
- Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C (5% CO 2).
- Wassen elk goed uit rijen 1 tot en met 3 met 1 mL ijskoud 1 X-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 5 min na toevoeging van puromycin aan putjes van de eerste rij (tweemaal wassen). Voeg 75 µL van 1 X Laemmli buffer (4% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 4% 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris-HCl pH 6.8, 0.004% bromophenol blauw, en 10% glycerol) te verkrijgen van geheel-cel lysates voor elke voorwaarde.
- Run 10% SDS-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) met behulp van 1/3 van de bereide monsters te beoordelen van de opneming van de puromycin.
- Bepalen het niveau van puromycin opneming van informatie door westelijke vlekkenanalyse met behulp van een anti-puromycin antistof (12 D 10) verdund in een verhouding van 1: 25.000 in primair antilichaam-incubatie buffer (2% bovien serumalbumine (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 en 0,01% natriumazide).
Opmerking: Representatieve beelden overeenkomt met andere cel lijn extracten gemaakt zoals beschreven in stap 1 worden getoond als voorbeelden in Figuur 2.
- Bepalen het niveau van puromycin opneming van informatie door westelijke vlekkenanalyse met behulp van een anti-puromycin antistof (12 D 10) verdund in een verhouding van 1: 25.000 in primair antilichaam-incubatie buffer (2% bovien serumalbumine (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 en 0,01% natriumazide).
2. In alexandrafranco Gelokaliseerde vertaling Visualization
Opmerking: de hier beschreven techniek werd gebruikt om te beoordelen van gelokaliseerde vertaling binnen SICs in cellen van de MRC-5 tijdens de hechting proces 5. Hoewel MRC-5 cellen hier gebruikt worden, andere cellijnen kunnen worden gebruikt met dezelfde methode zoals beschreven in stap 2.1.
- Cel voorbereiding.
- Losmaken MRC-5 cellen met behulp van 0,25% trypsine/2.21 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in Hank ' s evenwichtig zout oplossing (HBSS). De cellen door centrifugeren (5 min 200 x g) in een conische centrifugebuis van 15 mL pellet en hen op te schorten in Dulbecco ' s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) bij 40.000 cellen/mL na tellen met een tellen kamer.
- Broeden de zwevende cellen bij 37 ° C onder zachte rotatie met behulp van een rotator van de buis gedurende 20 minuten om ze te bewaren in suspensie.
Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang met het oog op de volledige dissociatie van de focale hechting complexen. - Plaat 2 mL van zwevende MRC-5 cellen (40.000 cellen/mL) in twee 35-mm glazen-bodem gerechten. Gebruik de eerste 35-mm glas-onder-schotel voor de puromycilation assay (zie stap 2.1.5) en gebruik maken van de tweede als een negatieve controle (zie stap 2.1.6).
- Houden van de cellen bij 37 ° C (5% CO 2) voor 55 min voor cellulaire hechting en SIC vorming.
- Toevoegen aan het medium in de 35-mm glazen-bodem gerechten (assay) met behulp van de concentratie eerder als omschreven in punt 1 puromycin. Gebruiken om te behandelen MRC-5 cellen, 10 µg/mL puromycin gedurende 5 minuten bij 37 ° C (5% CO 2).
- Als een negatieve controle, cycloheximide aan de tweede 35-mm glazen-bodem schotel 40 min toevoegen na het zaaien van de cellen om te vooraf te behandelen met 50 µg Mo/mL cycloheximide ( figuur 2B). Vervolgens 15 min na toevoeging van cycloheximide, puromycin toevoegen aan het medium gebruik dezelfde concentratie en incubatie tijd zoals in stap 2.1.5 (bijvoorbeeld gebruik 10 µg/mL puromycin gedurende 5 minuten bij 37 ° C (5% CO 2) voor MRC-5).
- Wassen elke plaat twee keer met 2 mL ijskoud 1 X PBS en herstellen van de cellen met 1 mL van 4% formaldehyde (verdund in 1 X PBS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
Let op: Paraformaldehyde moet uitsluitend worden gebruikt in een chemische kap.
- Immunokleuring.
- Na paraformaldehyde fixatie, was drie keer met 2 mL 1 X PBS en incubeer in 500 µL van PBS-TritonX-100 (0,5%) gedurende 20 min op RT om de cellen permeabilize.
- Blokkeren om te voorkomen dat niet-specifieke antilichaam-bindende, het monster met 500 µL PBS – BSA (1%) gedurende 20 minuten op RT.
- Spoel driemaal met 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) en incubeer met 300 µL van anti-puromycin antistof (12 D 10) verdund 1:12,500 in 1 X PBS voor 1 h op RT.
- Was 3 keer met 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) en incubeer met 300 µL van anti-muis IgG geconjugeerd met een fluorophore (hier, 488 nm) verdund in PBS te visualiseren puromycilated polypeptiden en met phalloidin-geconjugeerd aan een andere fluorophore (hier, 555 nm) om te visualiseren F-actine. Incubeer gedurende 1 h op RT.
- Spoel driemaal met 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) en vervolgens Incubeer gedurende 5 min. op RT in 300 µL van PBS-Tween20 (0,1%) aangevuld met 1 µg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Spoel driemaal met 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) en daarna wassen met 2 mL 1 X PBS. Voorkomen dat de cellen drogen door het bijhouden van het monster in 2 mL zuiver 1 X PBS tijdens Beeldacquisitie.
3. Immunefluorescentie Beeldacquisitie
Opmerking: de volgende methode kan worden gebruikt met alle verkrijgbare confocal imaging systeem.
- Bepalen de juiste instellingen voor elke fluorophore te maximaliseren van het dynamisch bereik voor kwantificering.
Opmerking: Vertegenwoordiger kwantificering kan alleen worden verkregen als pixel verzadiging wordt vermeden en de drempel van het signaal is goed aangepast. Deze instellingen kunnen worden bereikt door zorgvuldig aan te passen de kracht van de laser, hoogspanning (HV), krijgen, Naam module en verschuiving.- Aanpassen de zoom factor (5 X) en het aantal pixels (512 x 512) voor het optimaliseren van de pixelgrootte.
Opmerking: Dit moet ten minste 2,3 - maal kleiner is dan de optische resolutie, volgens de stelling van Nyquist. - Verlaag de snelheid van de scan (12,5-20 µs/pixel) en gebruiken gemiddeld (2 - 3 keer) ter verbetering van de signaal-/ ruisverhouding volgens de hierboven vermelde instellingen.
- Aanpassen de zoom factor (5 X) en het aantal pixels (512 x 512) voor het optimaliseren van de pixelgrootte.
- Handmatig bepalen van de juiste bovenkant en onderkant focal vliegtuigen langs de z-as met de optimale stap-grootte (0.4 µm/slice).
Opmerking: Het vliegtuig stap grootte wordt bepaald door de resolutie van de axiale gedeeld door 2.3, volgens de stelling van Nyquist. 20-25 lagen zijn meestal nodig zijn voor de gehele cel scherptediepte Adherente cellen. - Verwerven een confocal beeld van een hele eencellige met een 60 X Plan Apo olie onderdompeling doelstelling (1.42 numerieke diafragma).
4. Immunefluorescentie afbeelding kwantificering
- bepaling van verrijking.
- Open een afbeelding die overeenkomt met de z-plane laag van belang uit het gegevensbestand van de verworven cel met behulp van de ImageJ software (freeware beschikbaar op http://fiji.sc).
- Tekent een lijn met behulp van het gereedschap lijn tekening (Tool bar → rechte) door de regio's van de cel waar kwantificering is gewenst. De lijndikte wijzigen door te dubbelklikken op " rechte; " de intensiteitswaarden zal worden gemiddeld door de breedte van de lijn (vastgesteld op 8 in Figuur 3).
Opmerking: Een dunnere lijn heeft de voorkeur om te voorkomen dat signaal overlapping van verschillende structuren. - Nadat de lijn is goed ingesteld, de signaal-dichtheid langs de vastberaden as profile (menubalk → analyseren → Plot profiel).
Opmerking: Een nieuw venster wordt geopend waarin een profiel dat overeenkomt met de signaalsterkte voor elke pixel van het geselecteerde kanaal (specifieke fluorophore) langs de lijn voor de geselecteerde sectie van het z-vlak.- Herhaal het proces voor elk kanaal overeenkomt met de fluorophore gebruikt (dat wil zeggen, een kwantificering voor 488, één voor 568, en één voor 405).
Opmerking: De intensiteitswaarde signaal zal altijd worden besteld na de oriëntatie van de getekende lijn.
- Herhaal het proces voor elk kanaal overeenkomt met de fluorophore gebruikt (dat wil zeggen, een kwantificering voor 488, één voor 568, en één voor 405).
- Voor het verkrijgen van de numerieke grijs-scaled waarden voor elke pixel van het profiel dat overeenkomt met de kwantificeringen van de geselecteerde laag van het z-vlak, het kopiëren van de profielgegevens (menubalk in afbeeldingsvenster → kopie) en plak deze in een spreadsheetprogramma.
- Herhaal stap voor elke sectie van de z-plane van het verworven confocal beeld en elk kanaal waar kwantificering is gewenst 4.1.1-4.1.4.
Opmerking: De kwantificering van de verschillende lagen van het z-vlak kan worden gebundeld om te verkrijgen van een algemene beoordeling van de speciale verrijking van het signaal door de berekening van de waarde van de som van elke pixel langs de lijn voor elke laag van het z-vlak. Dit type te bundelen kan alleen worden bereikt als de getekende lijn identiek voor elke laag van de z-plane opgenomen in de gemiddelde waarden is. - Als een alternatieve methode voor de kwantificering van de gehele-cel van verschillende kanalen met een groot aantal lagen, gebruik maken van de macro met de naam StackprofileData (Zie het Aanvullende bestand).
Opmerking: Deze macro is https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt vrij toegankelijk en kan als volgt worden gebruikt:- Kopieer van de macro in een tekstbestand en sla it.
- Het afbeeldingsbestand waarin alle van de confocal lagen van de cel open.
- Trekken een lijn, zoals beschreven in stap 4.1.2, openen een nieuw schermpje importeren van de macro (menubalk → Plugins → macro's → uitvoeren), kies de eerder opgeslagen tekstbestand overeenkomt met de StackprofileData macro en klik op " Open. "
Opmerking: Na macro invoer, een nieuw venster met de naam " resultaten " wordt geopend en alle van de kwantificering langs de vastberaden as zal worden vermeld voor elke laag van het z-vlak en kanaal aanwezig in de afbeeldingsbestanden. - Kopieer de gegevens voor elk kanaal (menubalk → bewerken → kopie) te verkrijgen van de vertegenwoordiging van de grafische profiel overeenstemt met de ondermeer signaal. Plak deze in een spreadsheet-software. Bereken de som waarde van elk kanaal voor elke pixel langs de lijn voor elke laag van het z-vlak. Deze waarden gebruiken voor een grafische weergave kunt maken die vergelijkbaar is met de gepresenteerd in Figuur 3.
- Kwantificering van signaal in een aangewezen cellulaire oppervlakte- of volume.
- Het afbeeldingsbestand met ImageJ software geopend.
- Tekent een gebied om te duiden op het gebied van belang met behulp van de functie van de geometrische vorm (werkbalk → " rechthoek, " " ovaal, " of " veelhoek ").
Opmerking: De kwantificering waarde zal worden bepaald voor de oppervlakte die overeenkomt met het getekende formulier. - Aanpassen de drempel om te voorkomen dat elke achtergrond signaal (menubalk → afbeelding aanpassen → drempel); een nieuw venster zal verschijnen om te vertegenwoordigen van de pixel intensiteiten in histogram vorm. Wijzig de waarden voor opnemen/niet opnemen van pixels in de kwantificering met behulp van de schuifregelaar. Selecteer een drempel die rode pixels buiten de cel elimineert, zoals pixels gemarkeerd in het rood zal worden opgenomen in de kwantificering.
- Definieer de parameters van de meting om te kwantificeren van het signaal van de pixel in het geselecteerde gebied, zonder achtergrond signaal (menubalk → analyseren → Set metingen), en controleer de " limiet aan drempel " en de " geïntegreerde dichtheid " vakken.
- Meten de kwantitatieve waarden voor het geselecteerde gebied (menubalk → analyseren → maatregel).
Opmerking: Signaal intensiteit kwantificering zal worden gepresenteerd in een nieuw venster onder de " IntDen " identificatie, die het product van de gemiddelde grijze waarden en het aantal pixels binnen het geselecteerde gebied vertegenwoordigt. - Tekent een gebied waarin de gehele cel met behulp van een geometrische vorm (werkbalk → " rechthoek, " " ovaal, " of " veelhoek ") en ga verder met de stappen 4.2.3-4.2.5 om een waarde die overeenkomt met de totale signaal te verkrijgen. Berekening van de verhouding van het signaal binnen het geselecteerde gebied de hele signaal te verkrijgen van het percentage van het signaal binnen het interessegebied.
- Herhaal stappen 4.2.2-4.2.6 te verkrijgen van de kwantificering van cel volume voor elke z-plane. De geometrische vorm passen desgewenst.
- Kopieer/Plak de gegevens verkregen uit de " resultaten " windows voor elke laag van de z-plane in een spreadsheet voor grafische voorstelling en vindt een gemiddelde waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te nauwkeurig observeren vertaling gebeurtenissen met behulp van de opneming van de puromycin, is het van cruciaal belang om te bepalen van de optimale omstandigheden voor elke regel van de cel, omdat elk verschillende puromycin opneming kinetiek (Figuur 1)9,11 toont ,12,18. Vandaar, om te valideren puromycin integratie, is het nodig voor de behandeling van de cellijn van de gewenste met een gestandaardiseerde spectrum van toenemende concentraties van puromycin (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10,0 en 15,0 µg/mL) voor verschillende perioden (5 en 10 min). Om te beoordelen gelokaliseerde vertaling of een vroege reactie op medicamenteuze behandeling, een kortere incubatietijd is bij voorkeur (bijvoorbeeld minder dan 5 min), omdat het zorgt voor de directe beoordeling van de translationeel gebeurtenissen direct na een specifieke behandeling. Ideaal, het puromycin signaal moet gemakkelijk aantoonbaar maar moet ook voorkomen dat het punt van verzadiging (Figuur 2). Zoals afgebeeld in Figuur 2 (linker panelen), is de concentratie van een aanvaardbaar puromycin 7.5-10,0 µg/mL voor MRC-5 en HeLa, terwijl 5.0-7.5 µg/mL puromycin wordt voorgesteld voor Huh-7. Optimalisatie van de experimentele parameters is van cruciaal belang omdat het doel van deze methode is niet volledig remmen alle translationeel rek op het moment van opening maar label nieuw synthetized polypeptide kettingen tijdens de vertaling te detecteren acute variaties in de vertaling. Deze eerste fase in het protocol mag niet worden verwaarloosd, als buitensporig puromycin beschikbaarheid en langere behandeltijd zal leiden tot grote ongewenste gevolgen. Zoals aangegeven in Figuur 2 (juiste panelen), genereert cellen behandeld gedurende 10 minuten met een hoge puromycin concentratie meestal kleinere puromycilated polypeptiden (bijvoorbeeld Huh-7, 7.5 µg/mL of meer gedurende 10 minuten). Deze kleinere polypeptiden zal sneller verspreiden in de cel, die interfereren kan met nauwkeurig beoordelen subcellular localisatie. Een ander probleem is dat verhoogde proteolyse treedt op bij buitensporige puromycin behandeling19. Dit resultaat werd waargenomen in MRC-5 en HeLa cellen gedurende 10 min, waaruit bleek verminderde signaalsterkte in aanwezigheid van 10 of 15 µg/mL van puromycin behandeld. Beide van deze verschijnselen zijn misleidend als puromycin opneming wordt beoordeeld door immunofluorescentie omdat grotere verspreiding de nauwkeurige visualisatie van de lokalisatie van de vertaling voorkomt, overwegende dat de aantasting van het puromycin-geïnduceerde sterk vermindert detectie gevoeligheid. Deze ongewenste gevolgen zijn gemakkelijk vermeden door het goed definiëren van optimale proefomstandigheden, zoals beschreven in sectie 1 van het Protocol.
Tijdens het visualiseren van opneming van de puromycin, is het ook belangrijk om de juiste controles uitvoeren. Zoals blijkt uit figuur 3A, kan puromycin opneming efficiënt worden geblokkeerd door de toevoeging van 50 µg Mo/mL cycloheximide, een samengestelde bekend dat remt vertaling rek20 en dus puromycin integratie. Dit probleem wordt weergegeven in figuur 3B, waaruit blijkt dat cycloheximide behandeling efficiënt allermeest naar de signaal overeenkomt met puromycin opneming in aanhangend MRC-5 cellen voorkomen. Inderdaad, terwijl puromycilated peptiden kunnen worden gevisualiseerd in cellen die zijn behandeld met puromycin alleen, een zwak signaal wordt gedetecteerd in cellen die ook werden behandeld met cycloheximide onder identieke omstandigheden van de kleuring. Als alternatief, een ander antibioticum (anisomycin) kan ook worden gebruikt als een negatieve controle, aangezien het heeft de mogelijkheid om het blokkeren van peptide transferase activiteit5 en heeft aangetoond dat zo efficiënt als cycloheximide op het weren van opneming van de puromycin5 ,18
Na immunefluorescentie Beeldacquisitie is het mogelijk om te beoordelen van de algemene lokalisatie van puromycilated polypeptiden overeenkomt met nieuw synthetized eiwitten (Figuur 4). Afbeeldingslagen zijn geselecteerd op verschillende diepten binnen de Adherente cellen, waardoor de signaalsterkte in subcellular compartimenten in verschillende cel vliegtuigen worden beoordeeld. Als zodanig, is het mogelijk om te vergelijken de gelokaliseerde puromycilation reactie op de onderkant van de cel (figuur 4A), het midden van de cel (figuur 4B), of aan de bovenkant van de cel (figuur 4C). Ligt iets boven de ontluikende en maturating hechting structuren en worden SICs meestal waargenomen in het midden van de cel. Zoals verwacht, wordt intensieve puromycilation in SICs, suggereren dat mRNA vertaling geïsoleerd naar deze subcellular structuren is ontdekt. Zoals eerder vermeld, is het mogelijk om te vergelijken signaalsterkte langs een gewenste as. Deze vergelijking is alleen mogelijk als de beelden verkregen bevatten geen verzadigde pixels, die worden weergegeven in de grijswaardenafbeelding rood (tweede panelen vanaf de top) verkregen met behulp van de Microscoop besturingssoftware. Deze beelden kunnen worden geïmporteerd in de ImageJ software voor kwantificering en analyse van de intensiteit van de pixel langs een aangewezen as. De kwantificering van de pixel grafisch kan worden weergegeven (het middelste deelvenster) ter illustratie van de intensiteit van de relatieve pixel op aangewezen posities langs de as. Een dichtere blik bij het invoegen in de bovenste deelvensters toont SIC-actine grenzen (in rood) en een groene signaal binnen de structuur die correspondeert met zeer actieve vertaling gebeurtenissen, die zijn verrijkt binnen deze structuren (onderste gedeelte). Hoewel deze methode kwantificering niet de beste manier om te bepalen van het exacte percentage van de totale vertaling is, die zich in deze structuren, het is visueel informatief doordat voor de snelle beoordeling van signaalsterkte en is een goede benadering van de signaal distributie in de cel.
Voor het verkrijgen van een kwantitatieve verdeling van het signaal gedurende de hele cel, moet een andere methode worden gebruikt. Zoals afgebeeld in Figuur 5, is een van de belangrijkste stappen ter aanduiding van de gebieden van belang moeten worden gekwantificeerd voor elke z-plane samenstellen van de confocal afbeeldingsbestanden. Deze toewijzing kan worden bereikt met behulp van een ander tekengereedschap in ImageJ gevonden. Met behulp van deze methode, is het mogelijk te kwantificeren van een eengemaakte ruimte of meerdere gebieden, die kunnen dan worden vergeleken, afgetrokken, of zelfs samengesteld. De belangrijkste problemen zijn: (i) zoeken de optimale beeldvorming voorwaarden die voorkomen pixel verzadiging en achtergrond signaal, die misschien verkeerd de kwantitatieve waarde van de verkregen signaal, en (ii) optimale kalibratie van de drempel in ImageJ opzet. Ervan uitgaande dat beide voorwaarden optimaal zijn, is deze methode kwantificering zeer reproduceerbaar terwijl nog gemakkelijk uit te voeren. Vóór Beeldacquisitie is het ook belangrijk om zorgvuldig de grenzen van het boven- en ondergrenzen van de z-vliegtuigen van de cel die is geselecteerd voor de kwantificering. In het geval in Figuur 4gepresenteerd, het onderste gedeelte komt overeen met de resolutie limiet van de doelstelling, waarin vaak vluchtig fluorescentie, die de SIC/cel lichaam signaalverhouding verminderen kan besmetten. Zoals eerder genoemd, SICs zijn betrokken bij de vorming van de site van de hechting en rijping; Daarom, SIC structuren liggen iets boven de nieuwe vorming van hechting complexen, dat vluchtig fluorescentie van de onderste lagen uitsluit. Het SIC-gebonden puromycilation signaal is dus nauwelijks zichtbaar in de onderste gedeelten, overwegende dat wij duidelijk obs kunnenErve in het middelste gedeelte, verklaren de toegenomen verhouding van SIC/cel lichaam het signaal in de middelste regio in vergelijking met de bovenste of onderste vlakken.
Figuur 1. Experimentele vertegenwoordiging van de puromycin behandeling optimalisatie onder 1 beschreven.
(A) een 24-well vertegenwoordiging van cellen worden overgeënt tijdens het experiment (stap 1.1). (B) schematische weergave van stap 1.4 de middellange wijziging in rij 1 en 2 van de 24-well-plaat en de toevoeging van cycloheximide (CHX) aan elk putje van de derde rij voor een eindconcentratie van 50 µg/mL tonen. (C) schematische weergave van de puromycin behandeling in de tweede en derde rij (stap 1.6) 15 min na stap 1.4. (D) schematische weergave van de puromycin behandeling in de eerste rij (stap 1.8) 5 min na stap 1.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Bepaling van de optimale voorwaarden voor de opneming van de puromycin.
Westelijke vlekkenanalyse van de gehele-cel extraheren uit (A)MRC-5, (B) Huh-7, en (C) HeLa cellen, geïncubeerd met toenemende concentraties van puromycin (0, 2.5, 5, 7.5, 10, en 15 µg/mL) voor een periode van 5 minuten (linker panelen) of 10 min (rechts panelen). Puromycilated peptiden zijn waargenomen met behulp van een antilichaam tegen puromycin. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Remming van de puromycilation met behulp van cycloheximide.
(A) westelijke vlek tonen het effect van cycloheximide op een 5-min puromycilation assay. Efficiëntie van de opneming in het MRC-5, Huh-7 en HeLa cellen na mock (PBS 1 X) of cycloheximide behandeling. (B) Confocal afbeelding toont het effect van cycloheximide over opneming van de puromycin. MRC-5 cellen waren vooraf behandeld met PBS (mock) of cycloheximide gedurende 15 minuten en dan aangevuld met 10 µg/mL puromycin + PBS 1 X (linkerdeel) of 10 µg/mL puromycin + 50 µg/mL cycloheximide (rechtervenster) voor 5 min. Puromycilated eiwitten zijn aangetroffen met behulp van een antilichaam tegen puromycin (groen). F-actine werd ontdekt met behulp van phalloidin (rood), en de kern was bevlekt met DAPI (blauw). Hiermee voegt u aan de rechterkant komen overeen met een 2.5 x vergroting van het witte vak. Bars = 10 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Kwantificering van de translationeel activiteit in SICs in aanhangend MRC-5 cellen.
(A-C) Representatieve confocal beeld van aanhangend MRC-5 cellen behandeld met 10 µg/mL puromycin voor 5 min. Links naar de afbeeldingen komen overeen met de onder (A)midden (B)en de bovenste (C) gedeelten van de cel. De bovenste panelen tonen de puromycilated eiwitten opgespoord met behulp van een antilichaam tegen puromycin (groen). F-actine werd ontdekt met behulp van phalloidin (rood), en de kern was bevlekt met DAPI (blauw). Hiermee voegt u aan de rechterkant komen overeen met een 2 x vergroting van het witte vak. Bars = 10 μm. De middelste panelen tonen het ontbreken van verzadigde pixels, die zou zijn gemarkeerd in het rood. De lagere panelen vertonen een grafische weergave van puromycilated eiwitverrijking een aanhangend MRC-5 cel door het vergelijken van de signaalsterkte voor puromycin (groen), F-actine (rood) en DAPI (blauw) langs de cel as aangegeven door de witte pijl. (D-F) Links naar de afbeeldingen komen overeen met de 4.4 x vergroting tussenvoegsel van de SICs gepresenteerd in (A-C). De kwantificering toont de SIC-grens (rode pieken: actine), evenals gelokaliseerde vertaling binnen de SICs (groene pieken: puromycin) in de laagste (D), het midden (E), en de bovenste (F) -regio's van de cel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Geheel-cel signaal kwantificering van puromycilated eiwitten in aanhangend MRC-5 cellen.
(A) bepaling van het signaal binnen de verschillende gebieden van de onderlaag van de z-plane van een aanhangend MRC-5-cel. (Linker paneel) De selectie van gebied (I) die betrekking hebben op de totaliteit van de cel om een kwantitatieve waarde overeenkomt met de totale cellulaire signaal voor deze z-plane laag te verkrijgen. (Midden paneel) Selectie van de cellulaire oppervlakte die overeenkomt met de kern en de cytoplasmatische deel dat niet bevat SIC (II). (Rechtervenster) Visualisatie van de oppervlakte die overeenkomt om de SICs (III) door de waarde verkregen gebied II uit de verkregen voor de hele cel waarde af te trekken (gebied ik). Bars = 10 μm. (B) kwantitatieve pixelwaarden voor elk gebied in de tabel staan voor de beeltenis van de selectie van de gebieden in (A), gevolgd door een grafiek met het percentage (%) afbeelding van signaal gevonden in SICs. (C) bepaling van het signaal binnen de verschillende gebieden van de mid laag van het z-vlak van een aanhangend MRC-5-cel. (Linker paneel) De selectie van het gebied (I) die betrekking hebben op de totaliteit van de cel om een kwantitatieve waarde overeenkomt met de totale cellulaire signaal voor deze z-plane laag te verkrijgen. (Midden paneel) Selectie van de cel-oppervlakte die overeenkomt met de kern en de cytoplasmatische deel dat niet bevat SIC (II). (Rechtervenster) Visualisatie van de oppervlakte die overeenkomt om de SICs (III) door de waarde verkregen voor gebied II uit de verkregen voor de hele cel waarde af te trekken (gebied ik). (D) kwantitatieve pixelwaarden voor elk gebied in de tabel staan voor de afbeelding van de selectie van de gebieden in (C), gevolgd door een grafiek met het percentage (%) van het signaal gevonden in SICs. (E) bepaling van het signaal binnen de verschillende gebieden van de bovenste laag van het z-vlak van een aanhangend MRC-5-cel. (Linker paneel) De selectie van het gebied (I) die betrekking hebben op de totaliteit van de cel om een kwantitatieve waarde overeenkomt met het signaal van de cel Totaal voor deze z-plane laag te verkrijgen. (Midden paneel) selectie van de cel-oppervlakte die overeenkomt met de kern en de cytoplasmatische deel dat niet bevat SICs (II). (Rechtervenster) Visualisatie van de oppervlakte die overeenkomt om de SICs (III) door de waarde verkregen voor gebied II uit de verkregen voor de hele cel waarde af te trekken (gebied ik). (F) kwantitatieve pixelwaarden voor elk gebied in de tabel staan voor de afbeelding van de selectie van de gebieden in (E), gevolgd door een grafiek met het percentage (%) van het signaal gevonden in SICs. (G) kwantificering waarden voor alle z-plane lagen uit de cel die hierboven, met inbegrip van een berekend voor z-vliegtuigen gepresenteerd in A (z = 1), C (z = 9), en E (z = 19), die zijn gemarkeerd in het rood op de tafel. (H) grafische weergave van het percentage van signaal verspreid het volume van de gehele cel in SICs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Recente technologische vooruitgang hebben toegestaan voor een beter begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij translationeel opregulatie of de onderdrukking van specifieke mRNAs in biologische processen, zoals de neuronale ontwikkeling, drug reactie en metastase. De hier beschreven kosteneffectieve methode kunt vertaling gebeurtenissen worden gevisualiseerd in cellen om te bestuderen hoe RNA-bindende proteïnen reguleren metastatische processen, zoals cellulaire hechting, migratie en invasie.
Hoewel tal van methoden om te beoordelen van DOVO eiwit vertaling hebben ontwikkeld, delen zij allen dezelfde strategie, waarin de elongating polypeptide gewijzigde aminozuren zijn gelabeld met een aantoonbaar deel daarvan bevat. De eerste van deze methoden steunt op 35S-radiolabeled arginine opneming in het nieuw vertaalde eiwit. Hoewel het is efficiënt voor het vergelijken van de algemene tarieven van vertaling in specifieke omstandigheden, maakt het gebruik van radiolabeled aminozuren deze methode onaantrekkelijk aan meeste onderzoeksteams. Vandaar, de ontwikkeling van roman methoden gebruik van niet-radioactieve labels, zoals zonsondergang, Click-it, of de truc benadering, aangeboden nieuwe mogelijkheden te beoordelen en te observeren in vivo vertaling gebeurtenissen. Hoewel ingenieuze, toestaan meeste van deze methoden alleen voor de beoordeling van vertaling gebeurtenissen na medicamenteuze behandeling of specifieke cellulaire gebeurtenissen met behulp van een specifieke exogene cDNA bouwen van specifieke doelen, beperking van de experimenten aan reeds vastgestelde doelstellingen . Dit geldt voor de truc aanpak4, die het mogelijk voor de translationeel regulering van een enkele exogenously uitgedrukt mRNA doel maakt worden beoordeeld. Hoewel het zorgt voor de validatie van de translationeel activering van endogene mRNAs, is de "Click-IT" methode minimale incubatietijd voor AHA opneming ten minste 1 h13, die wordt beschouwd als te lang voor de meest acute vertaling mechanismen.
Hoewel zeer veelzijdig en gemakkelijk aan opstelling, vereist de hier beschreven methode dat de kritische stappen worden gevolgd in de beginfase van het protocol. Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, krijgen verschillende cellijnen opneming kinetiek van de verschillende puromycin, die gewoon als gevolg van de stofwisseling van elke cellijn wellicht, zoals het geval voor MRC-5 cellen5,21lijkt te zijn. Inderdaad, niet-getransformeerd cellen zijn niet zo proliferatieve als HeLa en eiwit massale vernieuwing dus minder robuust dan in getransformeerde cellen. Dit moet rekening worden gehouden bij het gebruik van het protocol. Het eerste gedeelte van het protocol is daarom cruciaal voor de rest van de methode. Zorgvuldig bepalen van de concentratie van puromycin en de duur van incubatie zal zorgen voor een betere evaluatie van de vertaling die zich voordoen tijdens het experiment. Zoals hierboven vermeld, de behandeling met een bovenmatige hoeveelheid puromycin verhoogt de verhouding tussen kleine puromycilated polypeptiden en lijkt te stimuleren proteolyse, die gemakkelijk tot een verkeerde interpretatie leiden kan van normaal voorkomende translationeel gebeurtenissen19 . Als een vuistregel, is hoe langer de incubatietijd, de minder puromycin nodig, een kortere incubatietijd overwegende dat een hogere concentratie van de puromycin. De concentratie/tijd kan worden aangepast aan bepaalde experimentele beperkingen.
De hier gepresenteerde methoden zijn hoogst aanpasbaar en kan eenvoudig worden aangepast volgens de behandeling toegepast of de biologische proces studeerde. Puromycin integratie voorziet in de snelle beoordeling van veranderingen in vertaling kinetiek gedurende een korte periode van tijd, terwijl de kwantificering methode zeer informatief beelden van cellulaire gebeurtenissen biedt. Hoewel krachtige, hebben deze methoden beperkingen die moeten worden beschouwd. Puromycin zullen worden opgenomen in eiwitten nieuw gesynthetiseerd uit alle mRNAs die actief zijn vertaald. Om deze reden, de hier beschreven methode van de puromycilation niet geschikt voor het bestuderen van specifieke doelen (dat wil zeggen, één mRNAs) misschien wel, maar het is ideaal om het verkrijgen van een algemeen overzicht van translationeel activiteit binnen een enkele cel of een cel bevolking. Zoals hierboven vermeld, overmatige puromycin heeft grote nadelen, en puromycin doseringen en behandeling tijden moeten zorgvuldig worden omschreven, zoals wordt voorgesteld in het protocol. Inderdaad, zoals weergegeven in Figuur 2, overmatige puromycin beschikbaarheid zal resulteren in de vorming van kleinere puromycilated polypeptiden die diffuus sneller in de cel, wat leidt tot onjuiste subcellular localisatie gegevens. Daarnaast is verhoogde proteolyse bekend dat zich voordoen na overmatige puromycin behandeling19, een effect dat in een volledig verlies van signaal resulteren kan.
Hoewel niet zo specifiek als het Click-it of truc methoden, de hier voorgestelde benadering is zeer toegankelijk en zorgt voor de snelle beoordeling van algemene veranderingen in vertaling kinetiek. Zelfs als er andere methodes zijn beter geschikt voor specifieke toepassingen, kunnen puromycin integratie testen worden uitgevoerd als een aanvullende controle. Inderdaad, als het experiment moet laten zien dat een specifiek streefcijfer van mRNA de enige getroffen in een bijzondere situatie is, is het nodig om te laten zien dat dit niet wordt veroorzaakt door een algemene stijging van de vertaling. Als zodanig, konden opneming van de negatieve puromycin leveren bewijs voor dit geval. Bovendien, deze methode is zeer geschikt voor het observeren van algemene veranderingen in vertaaltarieven. Dus, het kan worden gebruikt om te laten zien van een vertaling onderdrukking mechanisme, zoals in het geval van stress submodule vorming9, of om te valideren als cycloheximide behandeling gebruikt in de beginfase van translationeel complexe fractionering efficiënt blokkeert rek22. Het is ook belangrijk om te vermelden dat, hoewel de kwantificering methoden beschreven in de punten 2.3 en 2.4 betrekking op experimenten gericht hebben op puromycin kleuring, ze kunnen worden toegepast op elk type van de verzuilde kleuring met behulp van verschillende soorten fluorophores. Inderdaad, deze methoden kwantificering kunnen worden gebruikt om het kwantificeren van de cellulaire verdeling van een molecuul of eiwitten en zelfs de lokalisatie van een doel in een specifieke subcellular compartiment kunnen valideren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) voor de kritische lezing van het manuscript. Wij danken de cel Imaging eenheid van het Research Center voor hun technische bijstand. M.-É. Huot is een Junior 1 onderzoeker van het Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen nummer CIHR, MOP-286437 naar M.-É. Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
