Kvantitativa immunofluorescens åtgärd globala lokaliserad Översättning
Summary
Detta manuskript beskriver en metod för att visualisera och kvantifiera lokaliserad översättning händelser i subcellulär fack. Den strategi som föreslås i detta manuskript kräver en grundläggande confocal bildsystem och reagenser och är snabbt och kostnadseffektivt.
Abstract
De mekanismer som reglerar mRNA översättning är inblandade i olika biologiska processer, såsom germ line utveckling, celldifferentiering och organogenes, liksom i flera sjukdomar. Talrika publikationer har övertygande visat att särskilda mekanismer tätt reglera mRNA översättning. Ökat intresse för översättning-inducerad regleringen av proteinuttryck har lett till utvecklingen av nya metoder att studera och följa de novo proteinsyntes i cellulo. De flesta av dessa metoder är dock komplexa, vilket gör dem dyra och ofta begränsa antalet mRNA mål som kan studeras. Detta manuskript föreslår en metod som kräver endast grundläggande reagenser och en confocal fluorescens imaging system att mäta och visualisera de förändringar i mRNA översättning som sker i någon cellinje under olika förhållanden. Denna metod användes nyligen till att Visa lokaliserad översättning i vidhäftande celler subcellulära strukturer under en kort tid, vilket ger möjligheten att visualisera de novo översättning för en kort period under en mängd biologiska processer eller validera förändringar i translationell aktivitet som svar på specifika stimuli.
Introduction
Regleringen av översättning av olika cellulära funktioner har föranlett många forskargrupper att utveckla nya verktyg och metoder för att bestämma subcellulär lokalisering av mRNA översättning och reglerade proteinsyntes1,2 ,3,4. Dessa senaste tekniska framsteg möjliggör en bättre förståelse för de mekanismer som omfattar översättning uppreglering eller förtryck av specifika mRNA under biologiska processer, såsom neuronal utveckling, narkotika svar och metastas5 ,6,7,8. Men kräver de flesta av dessa metoder dyra eller farliga reagenser och särskild utrustning som inte kanske är tillgängliga för de flesta laboratorier. Som sådan, utvecklades en kostnadseffektiv metod för snabb bedömning av översättning händelser för att specifikt kringgå dessa potentiella problem. Denna metod upptäcker akut translationell modulationer som inträffar under specifika cellulära processer och tillåter också för lokalisering av översättning använder konfokalmikroskopi.
Metoderna som beskrivs här användes för att övervaka lokaliserad Översättning inom subcellulär fack kallas fördelande inledande centers (SIC)5. SICs är övergående strukturer finns i seedade celler som är lokaliserade ovanpå begynnande vidhäftning komplex. Även om SICs och vidhäftning komplex är distinkta, är deras öden nära förbundna. SICs är faktiskt kända att gradvis försvinna vid fokal vidhäftning komplexa mognad in en vidhäftning webbplats under den inledande fasen av vidhäftning. Vi fann att RNA-bindande proteiner kända för att specifikt styr mRNA översättning (t.ex. Sam68, FMRP och G3BP1) och polyadenylated RNAs berikades inom dessa strukturer5. Använder de metoder som beskrivs här, visade vi att regleringen av SIC-associerade mRNA översättning fungerar som en kontrollpunkt som möjliggör seedade celler för att konsolidera celladhesion. Denna metod, baserad på puromycin införlivande, kunde anses en anpassad version av den ytan avkänning av översättning assay (solnedgång). Protein puromycilation utvecklades ursprungligen för att mäta globala proteinsyntes priser med hjälp av en icke-radioaktivt märkt aminosyra, och erbjuder ett effektivt sätt att visualisera de novo proteinsyntes9. Denna metod förlitar sig på puromycin, ett antibiotikum som blockerar översättning genom för tidig kedjeavbrott i Ribosomen10inneboende beteende. Puromycin är faktiskt strukturliknande till tyrosyl-tRNA, som tillåter för iblandning i elongating peptidkedjor via bildandet av en peptidbindning. Puromycin bindning till en växande kedja peptid förhindrar emellertid en ny peptidbindning bildas med den nästa aminoacyl-tRNAen, eftersom puromycin har ett icke-hydrolyserbar amide band i stället för den hydrolyserbar ester bond Funna i tRNAs. Således, införlivandet av puromycin i elongating polypeptider resultat i förtida frisläppandet av många trunkerade puromycilated polypeptider motsvarar aktivt översatta mRNA9,11,12 .
Med den här metoden, det var möjligt att bedöma aktiv Översättning inom en kort tid änka (t.ex. 5 min) under cellulär adhesion med hjälp av en specifik antikropp riktad mot puromycin på celler som kompletterades med antibiotika för 5 minuters perioder bearbeta5vid olika tidpunkter under celladhesion. Precisionen i denna analys bygger på mycket specifika antikroppar riktade mot den puromycilated delen. Immunofluorescerande upptäckt av den puromycilated polypeptiden ger en allmän subcellulär fördelningen av nyligen översatt mRNA, som också kan kvantifieras med stor noggrannhet med confocal bildsystem.
Därför erbjuder denna metod ett relevant alternativ för ett stort antal laboratorier studerar translationell reglerande mekanismer som är inblandade i processer såsom neuronala granulering6,13,14, 15, morphogen mRNA lokalisering och översättning under utveckling16,17. Det är också väl lämpad att studera lokaliserade eller konkurrensbetingat översättning under snabba biologiska händelser, såsom cellmigration, vidhäftning eller invasion, eller helt enkelt bedöma läkemedelsbehandlingar som kan inducera translationell ändringar5, 7 , 18. Sammantaget denna metod möjliggör visualisering av lokaliserade eller kontrollerad översättning händelser på en snabb, exakt och kostnadseffektiv sätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Senaste tekniska framsteg har gjort för en bättre förståelse av mekanismerna som är involverade i translationell uppreglering eller förtryck av specifika mRNA i biologiska processer, såsom neuronal utveckling, narkotika svar och metastaser. De kostnadseffektiva metoder som beskrivs här tillåter översättning händelser till visualiseras i celler för att studera hur RNA-bindande proteiner reglerar metastaserande processer, såsom cellulär adhesion, migration och invasion.
Även om m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) för den kritiska behandlingen av manuskriptet. Vi tackar Cell Imaging enheten för Research Center för deras tekniskt bistånd. M.-É. Huot är en Junior 1 forskning lärd av Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Detta arbete fick stöd av kanadensiska institut för hälsa forskning (tilldela CIHR, mopp-286437 till M.-É. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
