Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução
Summary
Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.
Abstract
Os mecanismos de regulação tradução do mRNA estão envolvidos em diversos processos biológicos, tais como o desenvolvimento de linha germinal, diferenciação celular e organogênese, bem como em várias doenças. Inúmeras publicações têm demonstrado convincentemente que mecanismos específicos firmemente regulam tradução do mRNA. Aumento do interesse na regulação da expressão da proteína induzida em tradução tem levado ao desenvolvimento de novos métodos de estudar e seguir de novo proteína síntese em cellulo. No entanto, a maioria desses métodos é complexa, tornando-os dispendiosos e muitas vezes limitar o número de destinos de mRNA que podem ser estudados. Este manuscrito propõe um método que requer somente reagentes básicos e um sistema de imagens de fluorescência confocal para medir e visualizar as alterações na tradução de mRNA que ocorrem em qualquer linha de celular em diversas condições. Este método foi usado recentemente mostrar tradução localizada nas estruturas subcelulares de células aderentes durante um curto período de tempo, oferecendo assim a possibilidade de visualizar a tradução de novo por um curto período durante uma variedade de biológicas processos ou de Validando alterações na atividade translacional em resposta a estímulos específicos.
Introduction
O Regulamento de tradução por diferentes funções celulares levou muitas equipes de investigação para desenvolver novas ferramentas e métodos para determinar a Localização subcellular da tradução do mRNA e proteína regulamentado síntese1,2 ,3,4. Estes recentes avanços tecnológicos permitem uma melhor compreensão dos mecanismos que envolvem a tradução upregulation ou a repressão de mRNAs específicos durante processos biológicos, tais como o desenvolvimento neuronal, a resposta de drogas e metástase5 ,6,7,8. No entanto, a maioria desses métodos requerem equipamentos específicos que podem não estar disponíveis para a maioria dos laboratórios e reagentes caros ou perigosos. Como tal, um método de baixo custo para permitir a rápida avaliação de eventos de tradução foi desenvolvido para especificamente contornar esses problemas potenciais. Este método detecta modulações translacionais agudas que ocorrem durante os processos celulares específicos e também permite a localização de tradução usando microscopia confocal.
Os métodos descritos aqui foram usados para monitorar uma tradução localizada dentro de compartimentos subcellular chamado espalhamento iniciação centros (SIC)5. SICs são transitórias estruturas encontradas nas células semeadas que são localizadas no topo de complexos de adesão nascente. Embora SICs e complexos de adesão são distintos, seus destinos estão intimamente ligados. Com efeito, SICs são conhecidos por desaparecer gradualmente após maturação complexo de adesão focal em um site de adesão durante a fase inicial de adesão. Descobrimos que RNA-proteínas conhecidas para controlar especificamente tradução mRNA (por exemplo, Sam68, FMRP e G3BP1) e polyadenylated RNAs foram enriquecidos dentro estas estruturas5. Usando os métodos descritos aqui, nós mostramos que o Regulamento de SIC-associada mRNA tradução age como uma barreira, permitindo semeado células para consolidar a adesão celular. Este método, baseado na incorporação de puromicina, poderia ser considerado uma versão adaptada da superfície de sensoriamento de tradução do ensaio (pôr do sol). Originalmente desenvolvido para medir as taxas de síntese de proteína global usando um aminoácido não-radioativa etiquetado, proteína puromycilation oferece uma maneira eficiente de Visualizar de síntese de proteínas de novo 9. Esse método depende o comportamento intrínseco de puromicina, um antibiótico que bloqueia a tradução por meio de encerramento prematuro da cadeia no Ribossoma10. Com efeito, a puromicina é estruturalmente análoga ao tRNA-correntes, que permite a incorporação alongando cadeias peptídicas através da formação de uma ligação peptídica. No entanto, vinculação de puromicina para uma crescente cadeia peptídica impede que uma nova ligação peptídica sendo formado com o próximo aminoacil-tRNA, desde puromicina tem uma ligação Amida não hidrolisável em vez da ligação éster hidrolisável encontrada em tRNAs. Assim, a incorporação de puromicina alongando polipeptídeos resulta na liberação prematura de numerosos polipeptídeos de puromycilated truncado correspondente ativamente traduzido do mRNA9,11,12 .
Usando este método, foi possível avaliar tradução ativa dentro de uma viúva de curto período de tempo (por exemplo, 5 min) durante a adesão celular usando um anticorpo específico dirigido contra puromicina em células que foram suplementados com o antibiótico para períodos de 5-min em pontos de tempo diferentes durante a adesão célula processo5. A precisão deste teste depende altamente específicos anticorpos dirigidos contra a fracção puromycilated. Detecção de imunofluorescência do polypeptide puromycilated fornece uma repartição geral subcellular do mRNA recentemente traduzidas, que também pode ser quantificada com grande precisão usando sistemas de imagiologia confocal.
Portanto, esse método oferece uma opção relevante para um grande número de laboratórios estudando mecanismos de regulação traducional envolvidos em processos como granulação neuronal6,13,14, 15, morphogen mRNA de localização e tradução durante desenvolvimento16,17. Também é adequado para estudar tradução localizada ou compartimentada durante rápidas eventos biológicos, tais como a migração celular, adesão ou invasão, ou simplesmente avaliar tratamentos com drogas que podem induzir alterações translacional5, 7 , 18. em geral, esse método permite que para a visualização de eventos tradução localizadas ou controlada de uma forma rápida, precisa e econômica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avanços tecnológicos recentes permitiram uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação alta translacional ou a repressão de mRNAs específicos em processos biológicos, tais como o desenvolvimento neuronal, a resposta de drogas e metástase. A metodologia econômica descrita aqui permite que eventos de tradução ser visualizado em células para estudar como RNA-proteínas regulam processos metastáticos, como adesão celular, migração e invasão.
Apesar de inúmeros m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Quebec, Canadá) para a leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a célula Imaging unidade do centro de pesquisa para sua assistência técnica. M.-é Huot é um estudioso de pesquisa Junior 1 do de Fonds Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (número CIHR, MOP-286437 de M.-nao de concessão. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
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