Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation
Summary
Cet article décrit une méthode pour visualiser et quantifier les événements de traduction localisée dans les compartiments subcellulaires. L’approche proposée dans ce manuscrit nécessite un système d’imagerie confocal base et réactifs et est rapide et rentable.
Abstract
Les mécanismes régulant la traduction de l’ARNm sont impliqués dans divers processus biologiques, tels que le développement des lignes germe, la différenciation cellulaire et organogenèse, ainsi que dans plusieurs maladies. Convaincante, nombreuses publications ont montré que des mécanismes spécifiques réglementent étroitement traduction de l’ARNm. Un intérêt accru dans la régulation induite par la traduction de l’expression protéique a conduit à l’élaboration de nouvelles méthodes pour étudier et suivre de novo protéine synthèse en cellulo. Cependant, la plupart de ces méthodes est complexe, ce qui les rend plus coûteux et souvent limitant le nombre de cibles ARNm qui peuvent être étudiés. Cet article propose une méthode qui nécessite seulement de base réactifs et un système d’imagerie confocal fluorescence de mesurer et de visualiser les changements en traduction de l’ARNm qui se produisent dans n’importe quelle ligne de la cellule dans diverses conditions. Cette méthode a récemment été utilisée pour montrer la traduction localisée dans les structures subcellulaires des cellules adhérentes sur une courte période de temps, offrant ainsi la possibilité de visualiser de novo traduction pendant une courte période au cours de diverses biologiques processus ou de validation des modifications dans l’activité traductionnelle en réponse à des stimuli spécifiques.
Introduction
La régulation de la traduction par différentes fonctions cellulaires a incité de nombreuses équipes de recherche pour développer de nouveaux outils et méthodes pour déterminer la localisation subcellulaire de traduction de l’ARNm et de protéines réglementé synthèse1,2 ,3,4. Ces progrès technologiques récents permettent une meilleure compréhension des mécanismes impliquant upregulation de traduction ou de la répression des ARNm spécifiques au cours de processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et la métastase5 ,6,7,8. Cependant, la plupart de ces méthodes nécessite des réactifs coûteux ou dangereuses et des équipements spécifiques qui ne sont peut-être pas disponibles pour la plupart des laboratoires. À ce titre, il a développé une méthode rentable pour permettre l’évaluation rapide des événements de traduction pour précisément à contourner ces problèmes potentiels. Cette méthode détecte des modulations translationnelles aiguës qui se produisent au cours de processus cellulaires spécifiques et permet également la localisation de la traduction à l’aide de la microscopie confocale.
Les méthodes décrites ici ont été utilisés pour surveiller une traduction localisée dans les compartiments subcellulaires appelé épandage initiation centres (SIC)5. SICs sont transitoires structures trouvées dans les cellules ensemencées sont localisés sur le dessus de complexes d’adhérence naissante. Bien que SIC et complexes d’adhérence sont distinctes, leurs destins sont étroitement liés. En effet, SICs sont connus pour disparaître progressivement après maturation complexe adhérence focale dans un site d’adhésion au cours de la phase initiale de l’adhérence. Nous avons constaté que les protéines de liaison à l’ARN connues pour contrôler plus précisément traduction ARNm (p. ex., Sam68, FMRP et G3BP1) et polyadénylé RNAs sont enrichis au sein de ces structures5. En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons montré que la régulation de l’ARNm associés à SIC traduction agit comme un point de contrôle permettant ensemencé les cellules afin de consolider l’adhésion cellulaire. Cette méthode basée sur l’incorporation de la puromycine, pourrait être considérée une version adaptée de la détection de surface d’essai de traduction (coucher du soleil). Développé à l’origine pour mesurer les taux de synthèse protéique globale à l’aide d’un acide aminé non-radioactivement marqué, protéine puromycilation offre un moyen efficace pour visualiser de la synthèse protéique de novo 9. Cette méthode repose sur le comportement intrinsèque de la puromycine, un antibiotique qui bloque la traduction via la terminaison de la chaîne prématurée dans le ribosome10. En effet, la puromycine est structurellement analogue aux tyrosyl-tRNA, qui permet de l’incorporer dans allongeant chaînes peptidiques via la formation d’une liaison peptidique. Cependant, liaison de puromycine à une chaîne peptidique croissante empêche une nouvelle liaison peptidique se forment avec la prochain aminoacyl-tRNA, puisque la puromycine a une liaison amide non hydrolysables au lieu de la liaison ester hydrolysables dans l’ARNt. Ainsi, l’incorporation de puromycine allongeant polypeptides se traduit par la sortie prématurée de nombreux polypeptides puromycilated tronqué correspondant à activement traduction ARNm9,11,12 .
En utilisant cette méthode, il était possible d’évaluer la traduction au sein d’une veuve de peu de temps (par exemple, 5 min) au cours de l’adhésion cellulaire à l’aide d’un anticorps spécifique contre la puromycine sur les cellules qui ont été complétées par l’antibiotique pendant 5 min à différents moments au cours de l’adhésion cellulaire traiter5. La précision de ce test s’appuie sur les anticorps hautement spécifiques dirigés contre la portion puromycilated. Détection par immunofluorescence du polypeptide puromycilated fournit une répartition subcellulaire générale de l’ARNm nouvellement traduit, qui peut aussi être évalués avec une grande précision à l’aide de systèmes d’imagerie confocale.
Par conséquent, cette méthode offre une option pertinente pour un grand nombre de laboratoires d’étude des mécanismes de réglementation translationnelles impliqués dans des processus tels que la granulation neuronale6,13,14, 15, localisation d’ARNm autocatalytiques et traduction au cours du développement16,17. Il est aussi bien adapté à l’étude de traduction localisée ou compartimentée au cours rapides événements biologiques, tels que la migration cellulaire, adhérence ou invasion, ou simplement évaluer les traitements médicamenteux qui pourraient induire des changements translationnelle5, 7 , 18. dans l’ensemble, cette méthode permet la visualisation des événements de traduction localisée ou contrôlé d’une manière rapide, précise et rentable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès technologiques récents ont permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’upregulation translationnelle ou la répression d’ARNm spécifiques dans des processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et la métastase. La méthodologie économique décrite ici permet aux événements de traduction à visualiser dans les cellules afin d’étudier comment les protéines de liaison à l’ARN régulent les processus métastatiques, tels que l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions l’unité d’imagerie cellulaire du centre de recherche pour leur assistance technique. M.-é. Huot est chercheur Junior 1 du Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé (accorder le nombre des IRSC, MOP-286437 de m-É. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
