Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione
Summary
Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L’approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.
Abstract
I meccanismi che regolano la traduzione del mRNA sono coinvolti in diversi processi biologici, quali sviluppo di linea del germe, differenziazione cellulare e organogenesi, così come nelle malattie multiple. Numerose pubblicazioni hanno dimostrato in modo convincente che i meccanismi specifici regolano strettamente traduzione degli mRNA. Crescente interesse nella regolazione dell’espressione della proteina indotta da traduzione ha portato allo sviluppo di nuovi metodi per studiare e seguire de novo proteina sintesi in cellulo. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono complessa, che li rende costosi e spesso limitando il numero di mRNA bersaglio che possono essere studiate. Questo manoscritto propone un metodo che richiede solo reagenti di base e un sistema di imaging di fluorescenza confocale per misurare e visualizzare le modifiche nella traduzione di mRNA che si verificano in qualsiasi linea cellulare in varie condizioni. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per mostrare la versione localizzata nelle strutture subcellulari delle cellule aderenti in un breve periodo di tempo, offrendo così la possibilità di visualizzare la traduzione del de novo per un breve periodo durante una varietà di biologico processi o di convalida delle modifiche in attività traduzionale in risposta a stimoli specifici.
Introduction
La regolazione della traduzione di diverse funzioni cellulari ha spinto molti gruppi di ricerca per sviluppare nuovi strumenti e metodi per determinare la localizzazione subcellulare di traduzione del mRNA e proteina regolamentato sintesi1,2 ,3,4. Questi recenti progressi tecnologici consentono una migliore comprensione dei meccanismi che coinvolgono il upregulation di traduzione o la repressione di specifici mRNA durante i processi biologici, quali lo sviluppo neuronale, la risposta ai farmaci e metastasi5 ,6,7,8. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi richiedono costosi o pericolosi reagenti e attrezzature specifiche che potrebbero non essere disponibili per la maggior parte dei laboratori. Come tale, un metodo conveniente per consentire la rapida valutazione degli eventi di traduzione è stato sviluppato per eludere specificamente questi potenziali problemi. Questo metodo rileva acute modulazioni traslazionale che si verificano durante specifici processi cellulari e permette anche per la localizzazione di traduzione usando la microscopia confocal.
I metodi descritti qui sono stati utilizzati per monitorare la versione localizzata all’interno di compartimenti subcellulari chiamato diffusione iniziazione centri (SIC)5. SICs è transitori strutture si trovano in celle teste di serie che sono localizzate in cima a complessi di adesione nascente. Anche se SICs e complessi di adesione sono distinti, i loro destini sono strettamente collegati. Infatti, SICs è noto per gradualmente svaniscono con la maturazione di complessi di adesione focale in un sito di adesione durante la fase iniziale di adesione. Abbiamo scoperto che le proteine RNA-leganti notoriamente per controllare in modo specifico la traduzione del mRNA (ad es., Sam68, FMRP e G3BP1) e poliadenilazione RNAs sono stati arricchiti all’interno di queste strutture5. Utilizzando i metodi descritti qui, abbiamo mostrato che il regolamento di SIC-collegata mRNA traduzione agisce come un checkpoint che consente seminato cellule per consolidare l’adesione delle cellule. Questo metodo, basato sull’incorporazione con puromicina, potrebbe essere considerato una versione adattata del rilevamento del superficie di analisi di traduzione (tramonto). Originariamente sviluppato per misurare il tasso di sintesi proteica globale utilizzando un aminoacido non-radioattivo identificato, proteina puromycilation offre un modo efficiente per visualizzare proteine de novo sintesi9. Questo metodo si basa sul comportamento intrinseco del con puromicina, un antibiotico che blocca la traduzione attraverso termine chain prematuro nel ribosoma10. Infatti, con puromicina è strutturalmente analoga alla tyrosyl-tRNA, che consente per l’incorporazione nell’allungamento catene peptidiche attraverso la formazione di un legame peptidico. Tuttavia, associazione con puromicina ad una catena crescente del peptide impedisce un nuovo legame peptidico in formazione con successivo aminoacyl-tRNA, poiché con puromicina ha un legame di ammide non idrolizzabili invece di legame estere idrolizzabile trovato nel tRNA. Così, l’incorporazione di con puromicina allungando polipeptidi provoca il rilascio prematuro di numerosi polipeptidi troncato puromycilated corrispondente al attivamente tradotta mRNA9,11,12 .
Utilizzando questo metodo, è stato possibile valutare traduzione attiva all’interno di una vedova di breve periodo di tempo (ad es., 5 min) durante l’adesione cellulare, utilizzando un anticorpo specifico diretto contro con puromicina sulle cellule che sono stati completati con l’antibiotico per periodi di 5-min in diversi momenti durante il processo di adesione delle cellule5. La precisione di questo test si basa su altamente specifici anticorpi diretti contro la frazione di puromycilated. Immunofluorescente rilevamento del polipeptide puromycilated fornisce una ripartizione subcellulare generale del mRNA appena tradotta, che può anche essere quantificata con grande precisione utilizzando sistemi di imaging confocale.
Quindi, questo metodo offre un’opzione pertinente per un gran numero di laboratori di studiare i meccanismi di regolazione traduzionale coinvolti in processi come un neurone granulazione6,13,14, 15, morfogeno mRNA localizzazione e traduzione durante lo sviluppo16,17. È anche adatto per studiare traduzione localizzata o compartimenti durante rapidi eventi biologici, come ad esempio la migrazione cellulare, adesione o invasione, o semplicemente valutare trattamenti farmacologici che possano indurre cambiamenti traslazionale5, 7 , 18. nel complesso, questo metodo consente la visualizzazione degli eventi di traduzione localizzata o controllata in modo rapido, preciso e conveniente.
Protocol
Representative Results
Discussion
I recenti progressi tecnologici hanno consentito una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nel upregulation traslazionale o la repressione di specifici mRNA in processi biologici, quali lo sviluppo neuronale, risposta ai farmaci e metastasi. La metodologia conveniente qui descritta consente traduzione eventi possano essere visualizzati nelle celle per studiare come le proteine RNA-leganti regolano processi metastatici, come adesione cellulare, migrazione e invasione.
Anche se sono sta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringrazia il Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo l’unità di Imaging di cella del centro di ricerca per la loro assistenza tecnica. M.-é. Huot è un Junior 1 Research Scholar del Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Questo lavoro è stato supportato dal canadese istituti di salute ricerca (grant numero CIHR, MOP-286437 a M.-É. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
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