Kvantitative immunofluorescens foranstaltning globale lokaliseret Oversættelse
Summary
Dette manuskript beskriver en metode til at visualisere og kvantificere lokaliseret oversættelse begivenheder i subcellulært rum. Den tilgang, der foreslås i dette manuskript kræver en grundlæggende Konfokal billedbehandlingssystem og reagenser og er hurtig og omkostningseffektiv.
Abstract
De mekanismer, der regulerer mRNA oversættelse er involveret i forskellige biologiske processer, som Kim linje udvikling, Celledifferentiering og organogenesis, også i flere sygdomme. Talrige publikationer har overbevisende vist, at specifikke mekanismer stramt regulere mRNA oversættelse. Øget interesse i forordningen oversættelse-induceret ekspression af proteiner har ført til udviklingen af nye metoder til at studere og følge de novo protein syntese i cellulo. Men de fleste af disse metoder er kompleks, hvilket gør dem dyrt og ofte begrænser antallet af mRNA mål, der kan studeres. Dette manuskript foreslår en metode, der kræver kun grundlæggende reagenser og en Konfokal fluorescens imaging system til at måle og visualisere de ændringer i mRNA oversættelse, der forekommer i enhver celle linjen under forskellige betingelser. Denne metode blev for nylig brugt til at vise lokaliseret oversættelse subcellulært strukturerne for vedhængende celler over en kort periode, hvilket giver mulighed for at visualisere de novo oversættelse i en kort periode under en række biologiske processer eller til validering af ændringer i translationel aktivitet som svar på bestemte stimuli.
Introduction
Regulering af oversættelse af forskellige cellulære funktioner har foranlediget mange forskerhold at udvikle nye værktøjer og metoder til at bestemme den subcellulært lokalisering af mRNA oversættelse og reguleret protein syntese1,2 ,3,4. Disse seneste teknologiske fremskridt giver mulighed for en bedre forståelse af de mekanismer, som inddrager oversættelse Opregulering eller undertrykkelse af specifikke mRNAs under biologiske processer, såsom neuronal udvikling, drug svar og metastase5 ,6,7,8. De fleste af disse metoder kræver dog dyrt eller farlige reagenser og specifikke udstyr, som ikke måske er tilgængelige til de fleste laboratorier. Som sådan er blev en omkostningseffektiv metode til at give mulighed for hurtig vurdering af oversættelse begivenheder udviklet til specielt omgå disse potentielle problemer. Denne metode registrerer akut translationel modulationer, der opstår under specifikke cellulære processer og også giver mulighed for lokalisering af oversættelse ved hjælp af Konfokal mikroskopi.
De metoder, der beskrives her blev brugt til at overvåge lokaliseret oversættelse inden subcellulært rum kaldet sprede indledning Centre (SIC)5. SICs er forbigående strukturer findes i seedede celler, der er lokaliseret på toppen af spirende vedhæftning komplekser. Selvom SICs og vedhæftning komplekser er forskellige, hænger deres skæbner tæt sammen. SICs er blevet kendt for at gradvist forsvinde ved fokale vedhæftning komplekse modning i en vedhæftning site i den indledende fase af vedhæftning. Vi fandt, at RNA-bindende proteiner kendt specifikt styre mRNA oversættelse (f.eks. Sam68, FMRP og G3BP1) og polyadenylated RNA’er blev beriget inden for disse strukturer5. Ved hjælp af de metoder, der beskrives her, viste vi, at reguleringen af SIC-associerede mRNA oversættelse fungerer som et checkpoint tillader seedede celler for at konsolidere celle vedhæftning. Denne metode, baseret på puromycin vedtægter, kunne betragtes som en tilpasset version af den overflade sansning af oversættelse assay (solnedgang). Oprindeligt udviklet til at måle globale protein syntese satser ved hjælp af en ikke-radioaktivt mærket aminosyre, tilbyder protein puromycilation en effektiv måde at visualisere de novo protein syntese9. Denne metode bygger på den iboende opførsel af puromycin, et antibiotikum, der blokerer oversættelse gennem tidlig kæde afslutning i ribosomet10. Ja, puromycin er strukturelt svarer til tyrosyl-tRNA, som tillader til indbygning i forlængede peptid kæder via dannelsen af en peptidbinding. Puromycin binding til en voksende peptid kæde forhindrer imidlertid en ny peptidbinding fra at være dannet med den næste aminoacyl-tRNA, da puromycin har en ikke-hydrolyserbar akrylamid bond i stedet for hydrolyserbar ester obligation fundet i tRNAer. Således resulterer inkorporeringen af puromycin i forlængede polypeptider i for tidlig frigivelse af talrige afkortet puromycilated polypeptider svarende til aktivt oversatte mRNA9,11,12 .
Brug denne metode, det var muligt at vurdere aktive oversættelse inden for en kort tid enke (f.eks. 5 min) under cellulære vedhæftning ved hjælp af en bestemt antistof rettet mod puromycin på celler, der blev suppleret med antibiotika i 5-min perioder på forskellige tidspunkter i løbet af celle vedhæftning proces5. Præcisionen af denne analyse er baseret på meget specifikke antistoffer rettet mod puromycilated gruppe. Immunfluorescent påvisning af puromycilated polypeptid giver en generel subcellulært fordelingen af den nyligt oversatte mRNA, som også kan kvantificeres med stor nøjagtighed ved hjælp af Konfokal Billeddannende systemer.
Derfor tilbyder denne metode en relevant mulighed for et stort antal laboratorier at studere translationel regulerende mekanismer involveret i processer som neuronal granulering6,13,14, 15, morphogen mRNA lokalisering og oversættelse under udvikling16,17. Det er også velegnet til at studere lokaliserede eller opdelte oversættelse under hurtig biologiske hændelser, såsom celle migration, friktion eller invasion, eller blot vurdere medicinske behandlingsmetoder, der kan fremkalde translationel ændringer5, 7 , 18. samlet set denne metode giver mulighed for visualisering af lokaliserede eller kontrolleret oversættelse begivenheder i en hurtig, præcis og omkostningseffektiv måde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seneste teknologiske fremskridt har tilladt for en bedre forståelse af de mekanismer, der er involveret i translationel Opregulering eller undertrykkelse af specifikke mRNAs biologiske processer, såsom neuronal udvikling, drug svar og metastaser. Den omkostningseffektive metode beskrives her tillader oversættelse begivenheder til visualiseres i celler til at studere, hvordan RNA-bindende proteiner regulere metastatiske processer, såsom cellulære vedhæftning, migration og invasion.
Selv o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) for den kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker celle Imaging enhed af Forskningscentret for deres tekniske bistand. M.-É. Huot er en Junior 1 forskning lærd af Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Dette arbejde blev støttet af den canadiske institutter for sundhedsforskning (tildele nummeret CIHR, MOP-286437 til M.-É. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
