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Biochemistry

मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस वैश्विक स्थानीयकृत अनुवाद मापने के लिए

Published: August 22, 2017 doi: 10.3791/55909
Automatic Translation
1, 1,2
1Centre de Recherche sur le Cancer de l’Université Laval, Faculté de Médecine, Département de Biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Université Laval, 2CRCHU de Québec: L’Hôtel-Dieu de Québec

Summary

इस पांडुलिपि का वर्णन एक विधि कल्पना और उपसेलुलर डिब्बों में स्थानीयकृत अनुवाद घटनाओं को बढ़ाता है । इस पांडुलिपि में प्रस्तावित दृष्टिकोण एक बुनियादी फोकल इमेजिंग प्रणाली और रिएजेंट की आवश्यकता है और तेजी से और लागत प्रभावी है ।

Abstract

mRNA अनुवाद विनियमन तंत्र विभिंन जैविक प्रक्रियाओं, जैसे रोगाणु लाइन विकास, कोशिका विभेद, और organogenesis, साथ ही कई रोगों में शामिल हैं । कई प्रकाशनों के कायल है कि विशिष्ट तंत्र कसकर mRNA अनुवाद को विनियमित दिखाया है । प्रोटीन अभिव्यक्ति के अनुवाद प्रेरित नियमन में वृद्धि हुई ब्याज उपंयास तरीकों के विकास के लिए अध्ययन करने के लिए और cellulo में डी नोवो प्रोटीन संश्लेषण का पालन करने के लिए प्रेरित किया है । हालांकि, इन तरीकों की सबसे जटिल हैं, उंहें महंगा बना रही है और अक्सर mRNA लक्ष्य है कि अध्ययन किया जा सकता है की संख्या सीमित । इस पांडुलिपि को मापने के लिए और विभिन्न स्थितियों के तहत किसी भी सेल लाइन में होते हैं कि mRNA अनुवाद में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए केवल बुनियादी रिएजेंट और एक फोकल प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली की आवश्यकता है कि एक विधि का प्रस्ताव. इस विधि हाल ही में समय की एक छोटी अवधि में अनुयाई कोशिकाओं के उपसेलुलर संरचनाओं में स्थानीयकृत अनुवाद दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, इस प्रकार जैविक की एक किस्म के दौरान एक छोटी अवधि के लिए de नोवो अनुवाद visualizing की संभावना की पेशकश प्रक्रियाओं या विशिष्ट उत्तेजनाओं के जवाब में शोधों गतिविधि में परिवर्तन मांय की ।

Introduction

विभिंन सेलुलर कार्यों द्वारा अनुवाद का विनियमन कई अनुसंधान टीमों को प्रेरित किया है mRNA अनुवाद और विनियमित प्रोटीन संश्लेषण के उपसेलुलर स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए नए उपकरणों और तरीकों को विकसित करने के लिए1,2 ,3,4. ये हाल ही में तकनीकी अग्रिम अनुवाद विनियमन या जैविक प्रक्रियाओं के दौरान विशिष्ट mRNAs के दमन, जैसे न्यूरॉन विकास, दवा की प्रतिक्रिया, और मेटास्टेसिस के रूप में शामिल तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देते हैं5 ,6,7,8. हालांकि, इन तरीकों में से अधिकांश महंगी या खतरनाक रिएजेंट और सबसे प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है कि विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है । जैसे, एक लागत प्रभावी तरीका अनुवाद घटनाओं के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए विशेष रूप से इन संभावित मुद्दों को दरकिनार विकसित किया गया था । इस विधि विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान होते हैं और भी फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अनुवाद के स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है कि तीव्र शोधों मॉडुलन का पता लगाता है.

यहां वर्णित तरीके उपसेलुलर डिब्बों के भीतर स्थानीयकृत अनुवाद की निगरानी के लिए दीक्षा केंद्र (सिक)5प्रसार बुलाया इस्तेमाल किया गया । SICs नवजात आसंजन परिसरों के शीर्ष पर स्थानीयकृत कर रहे हैं कि अस्तव्यस्त कोशिकाओं में पाया क्षणिक संरचनाओं रहे हैं । हालांकि SICs और आसंजन परिसरों अलग हैं, उनके भाग्य बारीकी से जुड़े हुए हैं । दरअसल, SICs एक आसंजन साइट में आसंजन के आरंभिक चरण के दौरान फोकल आसंजन जटिल परिपक्वता पर धीरे से गायब हो जाते हैं । हमने पाया है कि आरएनए-बंधन प्रोटीन विशेष रूप से mRNA अनुवाद (जैसे, Sam68, FMRP, और G3BP1) को नियंत्रित करने के लिए जाना जाता है और polyadenylated RNAs इन संरचनाओं के भीतर5समृद्ध थे । यहां वर्णित विधियों का उपयोग करके, हमने दिखाया है कि सिक-संबद्ध mRNA अनुवाद का विनियमन एक चौकी के रूप में कार्य करता है जिससे कोशिका आसंजन को समेकित करने के लिए बीज कोशिकाओं की अनुमति होती है । इस विधि, puromycin निगमन पर आधारित है, अनुवाद परख (सूर्यास्त) की सतह संवेदन के एक अनुकूलित संस्करण माना जा सकता है । मूल रूप से वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण की माप करने के लिए विकसित एक गैर रेडियोधर्मी लेबल अमीनो एसिड का उपयोग कर, प्रोटीन puromycilation de नोवो प्रोटीन संश्लेषण9कल्पना करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है. इस विधि puromycin, एक एंटीबायोटिक है कि ribosome10में समय से पहले श्रृंखला समाप्ति के माध्यम से अनुवाद ब्लॉक के आंतरिक व्यवहार पर निर्भर करता है । दरअसल, puromycin संरचनात्मक रूप से tyrosyl के अनुरूप है-tRNA, जो एक पेप्टाइड बॉण्ड के गठन के माध्यम से पेप्टाइड श्रृंखला में शामिल करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, puromycin एक बढ़ती पेप्टाइड श्रृंखला के लिए बाध्यकारी अगले aminoacyl-tRNA के साथ गठन किया जा रहा से एक नया पेप्टाइड बांड रोकता है, के बाद से puromycin एक गैर hydrolysable hydrolysable में पाया एस्टर बांड के बजाय बांड के बीच है । इस प्रकार, कई कटा हुआ puromycilated polypeptides के समयपूर्व रिलीज में polypeptides परिणाम में puromycin के शामिल होने के लिए सक्रिय रूप से अनुवादित mRNA9,11,12 .

इस विधि का प्रयोग, यह एक कम समय विधवा के भीतर सक्रिय अनुवाद का आकलन करने के लिए संभव था (जैसे, 5 मिनट) सेलुलर आसंजन के दौरान एक विशिष्ट puromycin के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी कोशिकाओं है कि एंटीबायोटिक के साथ 5-ंयूनतम अवधि के लिए पूरक थे पर निर्देश सेल आसंजन प्रक्रिया के दौरान अलग समय बिंदुओं पर5। इस परख की परिशुद्धता अत्यधिक विशिष्ट puromycilated moiety के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी पर निर्भर करता है । puromycilated पॉलीपेप्टाइड के Immunofluorescent पता लगाने के नए अनुवादित mRNA, जो भी महान सटीकता के साथ मात्रा किया जा सकता है की एक सामांय उपसेलुलर पुनर्विभाजन प्रदान करता है फोकल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर ।

इसलिए, इस विधि के लिए एक प्रासंगिक विकल्प प्रदान करता है प्रयोगशालाओं का अध्ययन शोधों नियामक प्रक्रियाओं में शामिल ऐसे न्यूरॉन दानेदार6,13,14, 15, morphogen mRNA स्थानीयकरण, और अनुवाद के दौरान विकास16,17. यह भी अच्छी तरह से इस तरह के सेल प्रवास, आसंजन, या आक्रमण के रूप में तेजी से जैविक घटनाओं, के दौरान स्थानीयकृत या compartmentalized अनुवाद का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है, या केवल अनुवाद परिवर्तन पैदा हो सकता है कि दवा उपचार का आकलन5, 7 , 18. कुल मिलाकर, इस विधि में स्थानीयकृत या नियंत्रित अनुवाद घटनाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है एक तेजी से, सटीक, और लागत प्रभावी तरीका.

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. Puromycilation शर्तों का निर्धारण

< p class = "jove_content" > नोट: यह तकनीक MRC-5 सेल आसंजन प्रक्रिया के दौरान स्थानीयकृत अनुवाद का आकलन करने के लिए प्रयुक्त विधि का वर्णन करता है < सुप वर्ग = "xref" > ५ . के रूप में puromycilation किसी भी कोशिका में किया जा सकता है, यह महत्वपूर्ण है के लिए विशिष्ट सेल लाइनों के लिए puromycilation शर्तों का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, क्योंकि उपचार की स्थिति puromycin एकाग्रता और वांछित के संदर्भ में प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए समान नहीं हैं मशीन समय । दिखाने के लिए कैसे इन शर्तों परिभाषित कर रहे हैं, तीन उदाहरण सेल लाइनों ( यानी, हेला, MRC-5, और हह-7) अलग मशीन समय के लिए puromycin की सांद्रता बढ़ाने के साथ इलाज किया गया (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).

  1. परीक्षण से पहले उपयुक्त पूर्ण संस्कृति मध्यम 16 एच के ०.५ मिलीलीटर में एक 24 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं के समान संख्या में वृद्धि । बीज ३०,००० MRC-5 कोशिकाओं, ५०,००० हेला कोशिकाओं, या ५०,००० हह-7 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से. 60-70% से अधिक संगम ( figure 1a ) से बचने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. puromycin (0, 5, 10, 15, 20, और 30 & #181; g/एमएल) की सांद्रता बढ़ाने के साथ पूरा सेल संस्कृति माध्यम के १.५ मिलीलीटर के साथ 6 ट्यूबों तैयार करते हैं । ३७ & #176 पर पूर्व-उष्ण; C.
    3. puromycin मध्यम के प्रत्येक एकाग्रता के लिए
  3. (चरण १.२ में तैयार), 6 नई ट्यूबों में प्रत्येक ट्यूब से ०.५ मिलीलीटर हस्तांतरण और ५० & #181 के एक अंतिम एकाग्रता पर cycloheximide जोड़ने के लिए, g/एमएल सभी 6 नई ट्यूबों के लिए । ३७ & #176 पर पूर्व-उष्ण; C.
  4. पूर्ण संस्कृति मध्यम (पंक्ति 1 और 2) के ०.५ मिलीलीटर के साथ माध्यम बदल जाते हैं । तीसरी पंक्ति के लिए, ५० & #181 के साथ पूरक की ०.५ मिलीलीटर पूर्ण संस्कृति मध्यम जोड़ें; g/mL of cycloheximide (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ).
    नोट: Cycloheximide उपचार अपने अनुवाद बढ़ाव ब्लॉक करने की क्षमता के कारण प्रोटीन puromycilation के लिए सबसे अच्छा नकारात्मक नियंत्रण के रूप में स्थापित किया गया है । क्योंकि puromycin निगमन अनुवाद बढ़ाव की आवश्यकता है, cycloheximide उपचार puromycilated प्रोटीन संकेतों की हानि की ओर जाता है < सुप class = "xref" > 5 , < सुप class = "xref" > 18 .
    5. ३७ पर 15 मिनट के लिए
  5. मशीन & #176; ग (5% कं 2 ).
  6. puromycin मध्यम के चरण १.२ में तैयार की ०.५ मिलीलीटर जोड़ने के अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए दूसरी पंक्ति 0, २.५, 5, ७.५, 10, और 15 & #181; g/mL, क्रमशः, कॉलम A, B, C, D, E, और F. इसी समय, cycloheximide-पूरक मध्यम (चरण १.३) में puromycin की ०.५ मिलीलीटर को तीसरी पंक्ति में जोड़ें (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ).
  7. में 5 मिनट के लिए ३७ & #176; ग (5% कं 2 ).
  8. ०.५ एमएल जोड़ने के puromycin मध्यम चरण १.२ में तैयार करने के लिए पहली पंक्ति के अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए ०.०, २.५, 5, ७.५, 10, और 15 & #181; g/mL (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ).
  9. में 5 मिनट के लिए ३७ & #176; ग (5% कं 2 ).
  10. 1 करने के लिए पंक्तियों से एक अच्छी तरह से धोने के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बर्फ ठंडा 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) 5 मिनट पहली पंक्ति के कुओं को puromycin के अलावा के बाद (धो दो बार) । जोड़ ७५ & #181; 1x Laemmli बफर के एल (4% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), 4% 2-mercaptoethanol, ०.१२० एम Tris एचसीएल पीएच ६.८, ०.००४% bromophenol ब्लू, और 10% ग्लिसरॉल) प्रत्येक शर्त के लिए पूरे सेल lysates प्राप्त करने के लिए.
  11. रन 10% एसडीएस-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) का उपयोग कर तैयार नमूनों का 1/3 का आकलन करने के लिए puromycin शामिल है ।
    1. पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा puromycin निगमन के स्तर का निर्धारण एक विरोधी puromycin एंटीबॉडी (12D10) 1 के अनुपात में पतला का उपयोग: प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन बफर में 25000 (2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)), ४३० मिमी NaCl, 10 मिमी Tris पीएच ७.४, और ०.०१% सोडियम azide).
      नोट: चरण 1 में वर्णित के रूप में किए गए विभिंन कक्ष लाइन निष्कर्षों के संगत प्रतिनिधि छवियां < सशक्त वर्ग में उदाहरण के रूप में दिखाई जाती हैं = "xfig" > चित्र 2 .
< p class = "jove_title" > 2. मे Cellulo स्थानीयकृत अनुवाद दृश्य

< p class = "jove_content" > नोट: यहाँ वर्णित तकनीक आसंजन प्रक्रिया के दौरान MRC-5 कोशिकाओं में SICs के भीतर स्थानीयकृत अनुवाद का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया था < सुप वर्ग = "xref" > ५ . यद्यपि MRC-5 कक्षों का उपयोग यहां किया जाता है, अंय कक्ष रेखाओं को चरण २.१ में वर्णित समान पद्धति के साथ उपयोग किया जा सकता है ।

  1. सेल वडा.
    1. देताच MRC-5 कोशिकाओं का उपयोग ०.२५% trypsin/2.21 mM ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) इन हैंक & #39; एस बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (HBSS) । एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में (२०० x g पर 5 मिनट) केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को गोली और Dulbecco & #39 में उन्हें निलंबित; एस संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एक मतगणना कक्ष के साथ गिनती के बाद ४०,००० कोशिकाओं पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक.
    2. पर निलंबित कोशिकाओं को ३७ & #176; सी कोमल रोटेशन के तहत 20 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर का उपयोग कर उंहें निलंबन में बनाए रखने के लिए ।
      नोट: यह कदम फोकल आसंजन परिसरों की पूरी पृथक्करण के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    3. प्लेट निलंबित MRC के 2 मिलीलीटर-5 कोशिकाओं (४०,००० कोशिकाओं/एमएल) में २ ३५-mm ग्लास-नीचे व्यंजन । पहले ३५-mm ग्लास-puromycilation परख के लिए नीचे पकवान का प्रयोग करें (चरण 2.1.5 देखें) और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में दूसरे का उपयोग करें (कदम 2.1.6 देखें) ।
    4. कोशिकाओं पर रखें ३७ & #176; सी (5% सह 2 ) के लिए ५५ मिनट सेलुलर आसंजन और सिक गठन के लिए अनुमति देने के लिए.
    5. ३५-mm ग्लास नीचे व्यंजन (परख) पहले खंड 1 में परिभाषित एकाग्रता का उपयोग में मध्यम करने के लिए puromycin जोड़ें । MRC-5 कोशिकाओं का इलाज करने के लिए, 10 & #181 का उपयोग करें; g/mL puromycin 5 मिनट के लिए ३७ & #176; ग (5% कं 2 ).
    6. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, cycloheximide जोड़ने के लिए दूसरा ३५ मिमी ग्लास नीचे पकवान ४० मिनट के बाद कोशिकाओं को बोने के पूर्व उन्हें ५० & #181; g/mL cycloheximide (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा b ). फिर, 15 मिनट के बाद cycloheximide अलावा, चरण 2.1.5 के रूप में एक ही एकाग्रता और गर्मी के समय का उपयोग कर मध्यम करने के लिए puromycin जोड़ें ( उदा., का उपयोग करें 10 & #181; g/puromycin के एमएल 5 मिनट के लिए ३७ & #176; ग (5% कं 2 ) के लिए MRC-5).
    7. प्रत्येक प्लेट को दो बार आइस-कोल्ड 1x पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो लें और कक्ष के तापमान (RT) पर 15 मिनट के लिए 4% formaldehyde (1x पंजाब में पतला) के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
      चेतावनी: Paraformaldehyde कड़ाई से एक रासायनिक डाकू में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  2. Immunostaining.
    1. पालन paraformaldehyde निर्धारण, 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोने और ५०० & #181 में मशीन; पंजाब के एल-TritonX-१०० (०.५%) के लिए 20 मिनट के लिए RT पर permeabilize कोशिकाओं.
    2. विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को रोकने के लिए, ५०० & #181 के साथ नमूना ब्लॉक करें; L पंजाबस & #8211; BSA (RT.
      3. पर 20 मिनट के लिए 1%)
    3. तीन बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो-Tween20 (०.१%) और ३०० & #181 के साथ मशीन; विरोधी के एल puromycin एंटीबॉडी (12D10) पतला 1:12500 1x पंजाब में 1 के लिए ज आरटी पर
    4. 3 बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो-Tween20 (०.१%) और ३०० & #181 के साथ मशीन; विरोधी के एल माउस आईजीजी संयुग्मित एक fluorophore को (यहां, ४८८ एनएम) पंजाबियों में पतला को puromycilated polypeptides कल्पना और phalloidin-संयुग्मित के साथ एक और fluorophore (यहां, ५५५ एनएम के लिए) F-actin कल्पना करने के लिए । RT.
      5. में 1 एच के लिए मशीन
    5. तीन बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो-Tween20 (०.१%) और फिर ३०० & #181 में RT पर 5 मिनट के लिए मशीन; पंजाब के एल-Tween20 (०.१%) 1 & #181 के साथ पूरक; g/mL 4 & #39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    6. तीन बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो-Tween20 (०.१%) और फिर 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ धो लो । छवि अधिग्रहण के दौरान 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर में नमूना रखकर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के ।
< p class = "jove_title" > 3. Immunofluorescent छवि अधिग्रहण

< p class = "jove_content" > नोट: निम्नलिखित पद्धति किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फोकल इमेजिंग सिस्टम के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. ठहराव.
    के लिए डायनेमिक श्रेणी को अधिकतम करने के लिए प्रत्येक fluorophore के लिए उपयुक्त सेटिंग्स निर्धारित करें नोट: यदि पिक्सेल संतृप्ति से बचना है और संकेत थ्रेशोल्ड ठीक से समायोजित किया गया है तो प्रतिनिधि ठहराव केवल प्राप्त कर सकते हैं । ये सेटिंग्स ध्यान से लेजर शक्ति, उच्च वोल्टेज (एचवी), लाभ का समायोजन करके प्राप्त किया जा सकता है, और ऑफ़सेट ।
    1. पिक्सेल आकार ऑप्टिमाइज़ करने के लिए ज़ूम फ़ैक्टर (5x) और पिक्सेल्स की संख्या (५१२ x ५१२) समायोजित करें ।
      नोट: इस Nyquist प्रमेय के अनुसार, ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन से छोटी से कम २.३-बार होना चाहिए ।
    2. स्कैन गति (12.5-20 & #181; s/पिक्सेल) को घटाएं और ऊपर उल्लिखित सेटिंग्स के अनुसार सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करने के लिए औसत (2-3 times) का उपयोग करें ।
  2. मैंयुअल रूप से उपयुक्त ऊपर और नीचे फोकल विमानों के साथ Z-अक्ष इष्टतम कदम आकार के साथ निर्धारित (०.४ & #181; m/
    नोट: चरण आकार विमान Nyquist प्रमेय के अनुसार, २.३ द्वारा विभाजित अक्षीय संकल्प द्वारा निर्धारित किया जाता है । सामान्यतया, 20-25 परतें अनुयाई कक्षों की संपूर्ण कक्ष गहराई को कवर करने के लिए आवश्यक हैं ।
  3. एक 60X योजना एपीओ तेल विसर्जन उद्देश्य (१.४२ संख्यात्मक एपर्चर) के साथ एक पूरे एक सेल की एक फोकल छवि प्राप्त ।
< p class = "jove_title" > 4. Immunofluorescent इमेज ठहराव

  1. संवर्धन का संकल्प.
    1. एक छवि का अधिग्रहण सेल डेटा ImageJ सॉफ्टवेयर (http://fiji.sc पर उपलब्ध फ्रीवेयर) का उपयोग कर प्राप्त की है से ब्याज की z-विमान परत के अनुरूप खुला ।
    2. रेखा आरेखण उपकरण (उपकरण पट्टी & #8594; सीधे) कक्ष के क्षेत्रों के माध्यम से जहां ठहराव वांछित है का उपयोग कर लाइन ड्रा । पर डबल क्लिक करके रेखा की चौड़ाई संशोधित करें & #34; सीधे; & #34; तीव्रता मानों को पंक्ति की चौड़ाई के माध्यम से औसत किया जाएगा (< सशक्त वर्ग में 8 पर सेट = "xfig" > चित्रा 3 ).
      नोट: एक पतली लाइन अलग संरचनाओं से संकेत ओवरलैप से बचने के लिए पसंद किया जाता है.
    3. के बाद लाइन ठीक से सेट है, प्रोफ़ाइल निर्धारित अक्ष के साथ संकेत घनत्व (मेनू पट्टी & #8594; विश्लेषण & #8594; प्लॉट प्रोफ़ाइल).
      नोट: एक नई विंडो खुलेगी जिसमें चयनित z-विमान अनुभाग के लिए पंक्ति के साथ चयनित चैनल (विशिष्ट fluorophore) के प्रत्येक पिक्सेल के लिए संकेत तीव्रता के संगत एक प्रोफ़ाइल दिखाई देगी.
      1. fluorophore इस्तेमाल के लिए इसी प्रत्येक चैनल के लिए प्रक्रिया को दोहराने ( यानी, एक ठहराव के लिए ४८८, ५६८ के लिए एक, और ४०५ के लिए एक).
        नोट: सिग्नल तीव्रता मान हमेशा आरेखित रेखा के ओरिएंटेशन के बाद का आदेश दिया जाएगा ।
    4. चयनित z-विमान परत के quantifications करने के लिए संगत प्रोफ़ाइल के प्रत्येक पिक्सेल के लिए संख्यात्मक धूसर स्केल किए गए मान प्राप्त करने के लिए, प्रोफ़ाइल डेटा (छवि विंडो में मेनू पट्टी & #8594; प्रतिलिपि) की प्रतिलिपि बनाएं और इसे किसी स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में चिपकाएं ।
    5. दोहराने चरण शुू-4.1.4 के प्रत्येक z-विमान खंड के लिए अधिग्रहीत की गई फोकल छवि और प्रत्येक चैनल जहां ठहराव वांछित है ।
      नोट: अलग z-विमान परतों के ठहराव प्रत्येक जेड विमान परत के लिए लाइन के साथ प्रत्येक पिक्सेल के योग मूल्य की गणना करके संकेत के विशेष संवर्धन के एक सामान्य आकलन प्राप्त करने के लिए परित किया जा सकता है. पूलिंग के इस प्रकार केवल अगर रेखा से तैयार प्रत्येक z-विमान परत मतलब मूल्यों में शामिल के लिए समान है प्राप्त किया जा सकता है ।
    6. परतों की एक बड़ी संख्या के साथ विभिन्न चैनलों के पूरे सेल ठहराव के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में, StackprofileData नामक मैक्रो का उपयोग करें ( पूरक फ़ाइल देखें).
      नोट: यह मैक्रो https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt पर स्वतंत्र रूप से पहुंच योग्य है और इस रूप में उपयोग किया जा सकता है:
      1. मैक्रो को किसी पाठ फ़ाइल में चिपकाएं और उसे सहेजें ।
      2. उस छवि फ़ाइल को खोलें जिसमें कक्ष के सभी फोकल लेयर्स शामिल हों.
      3. चरण 4.1.2 में वर्णित के रूप में कोई रेखा आरेखित करें, मैक्रो आयात करने के लिए एक नई विंडो खोलें (मेनू पट्टी & #8594; प्लगइंस & #8594; मैक्रोज़ & #8594; चलाएं), StackprofileData मैक्रो के संगत पहले सहेजी गई पाठ फ़ाइल चुनें, और & #34; खोलें क्लिक करें । & #34;
        नोट: मैक्रो आयात करने के बाद, & #34 नाम की एक नई विंडो; results & #34; खुलेगा और सभी निर्धारित अक्ष के साथ ठहराव के प्रत्येक z-विमान परत और छवि फ़ाइलों में मौजूद चैनल के लिए सूचीबद्ध किया जाएगा.
      4. प्रत्येक चैनल के लिए डेटा की प्रतिलिपि बनाएं (मेनू पट्टी & #8594; Edit & #8594; प्रतिलिपि) संकेत quantifications के अनुरूप ग्राफ़िकल प्रोफ़ाइल प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए । इसे किसी भी स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में पेस्ट करें । प्रत्येक z-विमान परत के लिए लाइन के साथ प्रत्येक पिक्सेल के लिए प्रत्येक चैनल के योग मूल्य की गणना । एक ग्राफ़िकल प्रस्तुतिकरण को बनाने के लिए इन मानों का उपयोग करें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ .
        5. में प्रस्तुत एक के समान
  2. ठहराव संकेत के एक निर्दिष्ट सेलुलर क्षेत्र या मात्रा में ।
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ छवि फ़ाइल खोलें.
    2. एक क्षेत्र आकर्षित करने के लिए ज्यामितीय फार्म समारोह का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र निरूपित (उपकरण पट्टी & #8594; & #34; आयत, & #34; & #34; शाली, & #34; या & #34;p olygon & #34;).
      नोट: ठहराव मान तैयार किए गए प्रपत्र के लिए संगत क्षेत्र के लिए निर्धारित किया जाएगा ।
    3. किसी भी पृष्ठभूमि संकेत से बचने के लिए थ्रेशोल्ड स्तर समायोजित करें (मेनू पट्टी & #8594; इमेज एडजस्ट & #8594; थ्रेशोल्ड); हिस्टोग्राम फार्म में पिक्सेल तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक नई विंडो दिखाई देगा । स्लाइडर का उपयोग करके ठहराव में पिक्सेल्स शामिल करने के लिए मान बदलें । उस थ्रेशोल्ड का चयन करें जो कक्ष के बाहर लाल पिक्सेल को समाप्त करता है, क्योंकि लाल रंग में हाइलाइट की गई पिक्सेल ठहराव में शामिल की जाएगी.
    4. चयनित क्षेत्र के भीतर पिक्सेल संकेत को मापने के लिए माप मापदंडों को परिभाषित, पृष्ठभूमि संकेत के बिना (मेनू पट्टी & #8594; विश्लेषण & #8594; माप सेट), और जांच करने के लिए सुनिश्चित करें & #34; सीमा तक थ्रेशोल्ड & #34; और द & #34; एकीकृत घनत्व & #34; बक्.
    5. चयनित क्षेत्र के लिए मात्रात्मक मानों को मापने (मेनू पट्टी & #8594; विश्लेषण & #8594; माप).
      नोट: सिग् तीव्रता ठहराव को & #34 के तहत एक नई विंडो में प्रस् तुत किया जाएगा; IntDen & #34; पहचान, जो माध्य धूसर मान के उत्पाद और चयनित क्षेत्र के भीतर पिक्सेल की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है ।
    6. एक क्षेत्र है कि एक ज्यामितीय रूप (उपकरण पट्टी & #8594 का उपयोग कर पूरे सेल शामिल ड्रा; & #34; आयत, & #34; & #34; शाली, & #34; या & #34;p olygon & #34;) और कुल संकेत करने के लिए संगत मान प्राप्त करने के लिए चरणों 4.2.3-4.2.5 के साथ आगे बढ़ें । ब्याज के क्षेत्र के भीतर संकेत का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए पूरे संकेत पर चयनित क्षेत्र के भीतर संकेत के अनुपात की गणना.
    7. दोहराएँ चरण 4.2.2-4.2.6 प्रत्येक z-विमान के लिए कक्ष वॉल्यूम की ठहराव प्राप्त करने के लिए । आवश्यकतानुसार ज्यामितीय रूप में रूपांतरित करे ।
    8. Copy/& #34 से प्राप्त डेटा को पेस्ट करें; result & #34; ग्राफिकल चित्रण के लिए एक स्प्रेडशीट में प्रत्येक z-विमान परत के लिए windows और एक मतलब मूल्य खोजने के लिए ।

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Representative Results

सही अनुवाद puromycin का उपयोग कर घटनाओं का निरीक्षण करने के लिए, यह प्रत्येक सेल लाइन के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रत्येक अलग puromycin शामिल शो कैनेटीक्स (चित्रा 1)9,11 ,12,18. इसलिए, puromycin निगमन को मांय करने के लिए, यह आवश्यक है कि puromycin (१.०, २.५, ५.०, ७.५, १०.०, और १५.० µ g/एमएल) की सांद्रता बढ़ाने के मानकीकृत स्पेक्ट्रम के साथ वांछित सेल लाइन का इलाज समय के विभिंन अवधियों के लिए (5 और 10 मिनट) । स्थानीयकृत अनुवाद या नशीली दवाओं के उपचार के लिए एक प्रारंभिक प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, एक छोटी मशीन समय पसंद है (जैसे, से कम 5 मिनट), के रूप में यह सीधे एक विशिष्ट उपचार के बाद शोधों की घटनाओं के प्रत्यक्ष मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । आदर्श रूप में, puromycin संकेत आसानी से detectable होना चाहिए, लेकिन यह भी संतृप्ति बिंदु (चित्रा 2) से बचना चाहिए । के रूप में चित्रा 2 में चित्रित (बाएं पैनलों), एक स्वीकार्य puromycin एकाग्रता 7.5-10.0 µ जी/एमएल MRC-5 और हेला के लिए है, जबकि 5.0-7.5 µ g/एमएल puromycin के लिए सुझाव दिया है हह-7 । प्रयोगात्मक मापदंडों का अनुकूलन महत्वपूर्ण है क्योंकि इस विधि के लक्ष्य को पूरी तरह से दीक्षा के क्षण में सभी शोधों बढ़ाव को बाधित नहीं है, लेकिन अनुवाद के दौरान नव synthetized पॉलीपेप्टाइड जंजीरों को टैग करने के लिए तीव्र का पता लगाने अनुवाद में भिन्नता । प्रोटोकॉल में यह प्रारंभिक चरण, उपेक्षित नहीं किया जाना चाहिए के रूप में अत्यधिक puromycin उपलब्धता और विस्तारित उपचार के समय प्रमुख अवांछित परिणामों का कारण होगा । के रूप में चित्रा 2 (सही पैनल) में कहा गया है, एक उच्च puromycin एकाग्रता के साथ 10 मिनट के लिए इलाज कोशिकाओं ज्यादातर छोटे puromycilated polypeptides (जैसे, हह-7, ७.५ µ g/एमएल या 10 मिनट के लिए और अधिक उत्पंन होगा) । इन छोटे polypeptides सेल में और अधिक तेजी से फैलाना होगा, जो सही सेलुलर स्थानीयकरण का आकलन करने के साथ हस्तक्षेप कर सकता है । एक अंय समस्या यह है कि वृद्धि हुई प्रोटियोलिसिस अत्यधिक puromycin उपचार पर19होता है । यह परिणाम MRC में मनाया गया था-5 और हेला कोशिकाओं 10 मिनट है, जो 10 या 15 µ जी की उपस्थिति में कम संकेत तीव्रता से पता चला के लिए इलाज किया/puromycin के एमएल/ इन दोनों घटनाओं के भ्रामक है अगर puromycin निगमन इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मूल्यांकन किया जाता है क्योंकि वृद्धि प्रसार अनुवाद स्थानीयकरण के सटीक दृश्य रोकता है, जबकि puromycin-प्रेरित क्षरण बहुत कम हो जाती है खोज संवेदनशीलता । इन अवांछित परिणामों को प्रोटोकॉलके अनुभाग 1 में बताए गए अनुसार, इष्टतम प्रायोगिक शर्तों को ठीक तरह से परिभाषित करने से आसानी से बचा जा सके ।

जबकि visualizing puromycin निगमन, यह भी उचित नियंत्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है । जैसा कि चित्र 3ए में दिखाया गया है, puromycin को कुशलतापूर्वक ५० µ g/mL cycloheximide के अलावा द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, जो अनुवाद बढ़ाव20 को बाधित करने के लिए जाना जाता है और इस प्रकार puromycin शामिल है । यह व्यवहार चित्र 3 बीमें दिखाया गया है, जिससे पता चलता है कि cycloheximide उपचार ने अनुयाई MRC-5 कक्षों में puromycin शामिल करने के लिए संगत सिग्नल के अधिकांश को कुशलतापूर्वक रोका । वास्तव में, जबकि puromycilated पेप्टाइड्स puromycin के साथ ही इलाज किया कोशिकाओं में कल्पना की जा सकती है, एक कमजोर संकेत भी समान धुंधला शर्तों के तहत cycloheximide के साथ इलाज किया गया है कि कोशिकाओं में पता चला है. वैकल्पिक रूप से, एक और एंटीबायोटिक (anisomycin) भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में यह peptidyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधि को ब्लॉक करने की क्षमता है5 और puromycin निगमन अवरुद्ध पर cycloheximide के रूप में के रूप में कुशल होना दिखाया गया है5 ,18

immunofluorescent छवि अधिग्रहण के बाद, यह puromycilated polypeptides के सामान्य स्थानीयकरण नए synthetized प्रोटीन के लिए इसी का आकलन करने के लिए संभव है (चित्रा 4). छवि परतों अनुयाई कोशिकाओं के भीतर अलग गहराई पर चुना जाता है, उपसेलुलर डिब्बों में संकेत तीव्रता के लिए अलग सेल विमानों में मूल्यांकन की अनुमति । जैसे, यह संभव है कि कक्ष के नीचे स्थानीयकृत puromycilation प्रतिक्रिया (चित्र 4a), कक्ष के मध्य (आकृति 4B), या कक्ष के शीर्ष (चित्र 4c) की तुलना करें । नवजात और maturating आसंजन संरचनाओं से थोड़ा ऊपर स्थित, SICs ज्यादातर सेल के बीच में मनाया जाता है । जैसा कि अपेक्षित, तीव्र puromycilation SICs में पता चला है, सुझाव है कि mRNA अनुवाद इन उपसेलुलर संरचनाओं के लिए अलग है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, यह एक वांछित धुरी के साथ संकेत तीव्रता की तुलना करने के लिए संभव है. यह तुलना केवल संभव है अगर छवियों को प्राप्त नहीं संतृप्त पिक्सल है, जो ग्रेस्केल छवि में लाल दिखाई देते हैं (ऊपर से दूसरे पैनल) माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त शामिल नहीं है । इन छवियों ठहराव और एक निर्दिष्ट धुरी के साथ पिक्सेल तीव्रता के विश्लेषण के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है । पिक्सेल ठहराव रेखांकन (मध्य पैनल) का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है धुरी के साथ नामित पदों पर रिश्तेदार पिक्सेल तीव्रता उदाहरण देकर स्पष्ट करना । ऊपरी पैनलों में डालने पर एक करीब देखो सिक actin सीमाओं (लाल रंग में) और संरचना है कि अत्यधिक सक्रिय अनुवाद की घटनाओं, जो इन संरचनाओं (नीचे अनुभाग) के भीतर समृद्ध कर रहे है से मेल खाती है के भीतर एक हरी संकेत से पता चलता है । हालांकि इस ठहराव विधि का सबसे अच्छा तरीका इन संरचनाओं में होने वाले कुल अनुवाद का सही प्रतिशत निर्धारित नहीं है, यह संकेत तीव्रता के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के द्वारा नेत्रहीन जानकारीपूर्ण है और एक अच्छा सन्निकटन है सेल भर में सिग्नल वितरण ।

पूरे कक्ष में संकेत का एक मात्रात्मक वितरण प्राप्त करने के लिए, किसी अन्य विधि का उपयोग किया जाना चाहिए । के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है, महत्वपूर्ण कदमों में से एक के लिए ब्याज की जरूरत है कि हर z-फोकल छवि फाइल रचना विमान के लिए मात्रा होने के क्षेत्रों को निरूपित है । इस असाइनमेंट ImageJ में पाया एक अलग ड्राइंग उपकरण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । इस विधि का उपयोग करना, यह या तो एक ही क्षेत्र या एकाधिक क्षेत्रों है, जो तब की तुलना में, घटाया जा सकता है, या यहां तक कि संकलित यों तो संभव है । मुख्य कठिनाइयों के लिए कर रहे हैं: (i) पिक्सेल संतृप्ति और पृष्ठभूमि संकेत है, जो प्राप्त संकेत के मात्रात्मक मूल्य मिथ्या सकता है, और (ii) ImageJ में दहलीज के इष्टतम अंशांकन स्थापित करने से बचने के इष्टतम इमेजिंग शर्तों पाते हैं । यह मानते हुए कि इन स्थितियों के दोनों इष्टतम हैं, इस ठहराव विधि अत्यधिक प्रतिलिपि है, जबकि अभी भी प्रदर्शन करने के लिए आसान शेष । छवि अधिग्रहण करने से पहले, यह भी ध्यान से ठहराव के लिए चयनित सेल के जेड विमानों की निचली और ऊपरी सीमा का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । चित्रा 4में प्रस्तुत मामले में, नीचे अनुभाग उद्देश्य है, जो अक्सर प्रदूषित evanescent प्रतिदीप्ति, जो सिक/सेल शरीर संकेत अनुपात कम कर सकते है शामिल की संकल्प सीमा से मेल खाती है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, SICs आसंजन साइट गठन और परिपक्वता में शामिल हैं; इसलिए, सिक संरचनाओं नए बनाने आसंजन परिसरों के ऊपर थोड़ा ऊपर स्थित हैं, जो नीचे से सबसे परतें evanescent प्रतिदीप्ति शामिल नहीं है । इस प्रकार, सिक-बाउंड puromycilation सिग्नल बमुश्किल नीचे के अनुभागों में दिखाई देता है, जबकि हम स्पष्ट रूप से obs कर सकते हैंमध्यम खंड में erve, कम या ऊपरी विमानों की तुलना में मध्य क्षेत्र में सिक/सेल शरीर संकेत की वृद्धि हुई अनुपात समझा ।

Figure 1
चित्र 1. puromycin उपचार अनुकूलन के प्रायोगिक प्रतिनिधित्व खंड 1 में वर्णित है ।
(a) प्रयोग के लिए वरीयता प्राप्त कक्षों का 24-well निरूपण (step १.१) । (ख) कदम १.४ के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 1 पंक्तियों में मध्यम परिवर्तन दिखा रहा है और 24 के 2 अच्छी तरह से थाली और cycloheximide के अलावा (CHX) ५० µ g/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए तीसरी पंक्ति के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए । (ग) दूसरी और तीसरी पंक्तियों (चरण १.६) में puromycin उपचार के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चरण १.४ के बाद 15 मिनट । (घ) पहली पंक्ति (चरण १.८) में puromycin उपचार के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चरण १.६ के बाद 5 मिनट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. puromycin निगमन के लिए इष्टतम शर्तों का निर्धारण ।
पूरी-सेल निकालने के पश्चिमी दाग विश्लेषण से (क)MRC-5, (ख) हह-7, और (ग) हेला कोशिकाओं, puromycin की सांद्रता बढ़ाने के साथ मशीन (0, २.५, 5, ७.५, 10, और 15 µ g/एमएल) 5 मिनट की अवधि के लिए (बाएं पैनल) या 10 मिनट (दाएं पैनलों) । Puromycilated पेप्टाइड्स puromycin के विरुद्ध एक एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. cycloheximide का उपयोग puromycilation के निषेध ।
(क) पश्चिमी एक 5-ंयूनतम puromycilation परख पर cycloheximide के प्रभाव दिखा दाग । MRC में निगमन दक्षता-5, हह-7, और नकली (पंजाबियों 1x) या cycloheximide उपचार के बाद हेला कोशिकाओं । (ख) फोकल छवि puromycin निगमन पर cycloheximide के प्रभाव दिखा । MRC-5 कोशिकाओं को पहले या तो पंजाब (नकली) या 15 मिनट के लिए cycloheximide के साथ इलाज किया और फिर 10 µ जी के साथ पूरक थे/puromycin के एमएल + पंजाबियों 1x (बाएं पैनल) या 10 µ g/puromycin की एमएल + ५० µ जी/एमएल के cycloheximide (सही पैनल) के लिए 5 मिनट । Puromycilated प्रोटीन का पता लगाया गया puromycin (हरा) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करना । F-actin phalloidin (लाल) का उपयोग कर पाया गया था, और नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग था । सही पर आवेषण सफेद बॉक्स के एक 2.5 x आवर्धन के अनुरूप है । सलाखों = 10 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. अनुयाई MRC-5 कक्षों में SICs में शोधों की गतिविधि का ठहराव ।
(A-C) अनुयाई MRC की प्रतिनिधि फोकल छवि-5 कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 10 µ जी/एमएल puromycin के साथ इलाज किया । प्रस्तुत चित्र नीचे (A), मध्य (B), और कक्ष के ऊपरी (C) भागों के अनुरूप हैं । ऊपरी पैनलों puromycilated प्रोटीन puromycin (हरा) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर पता चलता है । F-actin phalloidin (लाल) का उपयोग कर पाया गया था, और नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग था । सही पर आवेषण सफेद बॉक्स के एक 2x इज़ाफ़ा करने के लिए अनुरूप । सलाखों = 10 माइक्रोन । मध्य पैनलों संतृप्त पिक्सल है, जो लाल रंग में डाला गया होगा के अभाव दिखा । कम पैनलों एक अनुयाई MRC में puromycilated प्रोटीन संवर्धन के एक ग्राफिक प्रतिनिधित्व दिखाने-5 सेल puromycin के लिए संकेत तीव्रता (हरा), एफ actin (लाल) की तुलना द्वारा, और DAPI (नीला) सेल अक्ष के साथ सफेद तीर द्वारा संकेत दिया । (डी एफ) प्रस्तुत चित्र (A-C) में प्रस्तुत SICs के 4.4 x आवर्धन सम्मिलित करने के लिए संगत है । ठहराव सिक बॉर्डर (लाल चोटियों से पता चलता है: actin), के रूप में अच्छी तरह के रूप में SICs के भीतर स्थानीयकृत अनुवाद (हरी चोटियों: puromycin) में सबसे कम (D), मध्य (E), और कक्ष के ऊपरी (F) क्षेत्रों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. अनुयाई MRC-5 कोशिकाओं में puromycilated प्रोटीन के पूरे सेल सिग्नल ठहराव ।
(क) एक अनुयाई MRC-5 सेल के नीचे z-विमान परत के विभिंन क्षेत्रों के भीतर संकेत का निर्धारण । (बायां फलक) क्षेत्र का चयन (I) इस z-विमान परत के लिए कुल सेलुलर संकेत करने के लिए इसी मात्रात्मक मान प्राप्त करने के लिए सेल की समग्रता को कवर । (मध्य कक्ष) सेलुलर क्षेत्र के नाभिक के लिए इसी का चयन और cytoplasmic भाग है कि सिक (II) शामिल नहीं है । (दायां फलक) SICs के लिए इसी क्षेत्र के दृश्य (III) पूरे सेल (क्षेत्र मैं) के लिए प्राप्त मूल्य से क्षेत्र द्वितीय से प्राप्त मूल्य घटाकर द्वारा । सलाखों = 10 माइक्रोन । (ख) प्रत्येक क्षेत्र के लिए मात्रात्मक पिक्सेल मूल्यों तालिका में (ए) में क्षेत्र के चयन का चित्रण छवि के लिए सूचीबद्ध हैं, एक SICs में पाया संकेत के अनुपात (%) दिखा ग्राफ के बाद । (ग) एक अनुयाई MRC-5 सेल के मध्य z-विमान परत के विभिंन क्षेत्रों के भीतर संकेत का निर्धारण । (बायां फलक) क्षेत्र का चयन (I) इस z-विमान परत के लिए कुल सेलुलर संकेत करने के लिए इसी मात्रात्मक मूल्य प्राप्त करने के लिए सेल की समग्रता को कवर । (मध्य कक्ष) नाभिक के लिए इसी सेल क्षेत्र का चयन और cytoplasmic भाग है कि सिक (II) शामिल नहीं करता है । (दायां फलक) SICs के लिए इसी क्षेत्र के दृश्य (III) पूरे सेल (क्षेत्र मैं) के लिए प्राप्त मूल्य से क्षेत्र द्वितीय के लिए प्राप्त मूल्य घटाकर द्वारा । (D) प्रत्येक क्षेत्र के लिए मात्रात्मक पिक्सेल मान तालिका में क्षेत्र चयन को दर्शाने वाली छवि के लिए सूचीबद्ध होते है (C), जिसके बाद SICs में मिले सिग्नल के अनुपात (%) (ङ) एक अनुयाई MRC-5 सेल के ऊपरी z-विमान परत के विभिंन क्षेत्रों के भीतर संकेत का निर्धारण । (बायां फलक) क्षेत्र का चयन (I) इस z-विमान परत के लिए कुल सेल संकेत करने के लिए संगत एक मात्रात्मक मान प्राप्त करने के लिए सेल की समग्रता को कवर । (मध्य पैनल) नाभिक के लिए इसी सेल क्षेत्र का चयन और cytoplasmic भाग है कि SICs (II) शामिल नहीं करता है । (दायां फलक) SICs के लिए इसी क्षेत्र के दृश्य (III) पूरे सेल (क्षेत्र मैं) के लिए प्राप्त मूल्य से क्षेत्र द्वितीय के लिए प्राप्त मूल्य घटाकर द्वारा । (च) प्रत्येक क्षेत्र के लिए मात्रात्मक पिक्सेल मान तालिका में क्षेत्र चयन (E) में दर्शाई जाने वाली छवि के लिए सूचीबद्ध होते हैं, जिसके बाद SICs में मिले सिग्नल के अनुपात (%) (छ) ऊपर प्रस्तुत कक्ष से z-विमान परतों के सभी के लिए ठहराव मूल्यों, एक जेड के लिए गणना सहित एक (z = 1), सी (जेड = 9), और ई (z = 19), जो मेज पर लाल रंग में प्रकाश डाला जाता है में प्रस्तुत विमानों । (H) संपूर्ण कक्ष खंड में SICs में मिले सिग्नल के प्रतिशत का ग्राफ़िकल प्रस्तुतिकरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हाल ही में तकनीकी विकास के लिए शोधों में शामिल तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति दी है विनियमन या जैविक प्रक्रियाओं में विशिष्ट mRNAs के दमन, जैसे कि ंयूरॉन विकास, दवा की प्रतिक्रिया, और मेटास्टेसिस । लागत प्रभावी पद्धति यहां वर्णित अनुवाद घटनाओं कोशिकाओं में visualized करने के लिए अध्ययन कैसे आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं, जैसे सेलुलर आसंजन, प्रवास, और आक्रमण के रूप में विनियमित करने की अनुमति देता है ।

हालांकि कई तरीकों de नोवो प्रोटीन अनुवाद का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है, वे सब एक ही रणनीति है, जिसमें लंबी पॉलीपेप्टाइड संशोधित एमिनो एक जासूस moiety के साथ टैग एसिड शामिल थे हिस्सा । इन तरीकों में से पहले ३५S-radiolabeled arginine में शामिल नव अनुवादित प्रोटीन पर निर्भर करता है । हालांकि यह विशिष्ट शर्तों के तहत अनुवाद की सामांय दरों की तुलना के लिए कुशल है, radiolabeled अमीनो एसिड का उपयोग इस विधि सबसे अनुसंधान टीमों के लिए अपील नहीं करता है । इसलिए, उपंयास ऐसे सूर्यास्त के रूप में गैर रेडियोधर्मी लेबल, का उपयोग कर तरीकों के विकास, क्लिक करें, या चाल दृष्टिकोण, नए अवसरों का आकलन करने की पेशकश की और vivo में अनुवाद की घटनाओं का पालन करें । हालांकि सरल, इन तरीकों के अधिकांश केवल दवा उपचार या विशिष्ट सेलुलर एक विशिष्ट लक्ष्य के निर्माण का उपयोग कर घटनाओं के बाद अनुवाद की घटनाओं के आकलन के लिए अनुमति देते हैं, पहले से ही पहचान लक्ष्य के लिए प्रयोग सीमित . यह चाल दृष्टिकोण के लिए सच है4, जो एक एकल exogenously के शोधों के विनियमन के लिए अनुमति देता है mRNA लक्ष्य का मूल्यांकन किया जाना व्यक्त किया । हालांकि यह अंतर्जात mRNAs के अनुवाद सक्रियण के सत्यापन के लिए अनुमति देता है, "क्लिक करें, यह विधि" अहा निगमन के लिए ंयूनतम समय से कम मशीन के लिए 1 है, जो भी सबसे तीव्र अनुवाद तंत्र के लिए लंबे समय माना जाता है ।

जबकि उच्च बहुमुखी और स्थापित करने के लिए आसान है, यहां वर्णित विधि की आवश्यकता है कि महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरण में पालन किया जाना है । के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, अलग सेल लाइनों अलग puromycin निगमन कैनेटीक्स, जो सिर्फ एक सेल लाइन के चयापचय दर के कारण हो सकता है, के रूप में MRC के लिए मामला-5 कोशिकाओं5,21लगता है हो जाएगा । वास्तव में, गैर रूपांतरित कोशिकाओं हेला के रूप में प्रफलन के रूप में नहीं हैं, और इसलिए, प्रोटीन द्रव्यमान नवीकरण रूपांतरित कोशिकाओं की तुलना में कम मजबूत है । यह खाते में प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय लिया जाना चाहिए । तदनुसार, प्रोटोकॉल का पहला भाग विधि के बाकी के लिए महत्वपूर्ण है । ध्यान से puromycin की एकाग्रता का निर्धारण और मशीन की लंबाई प्रयोग के दौरान होने वाले अनुवाद का एक बेहतर आकलन के लिए अनुमति देगा । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, puromycin की एक अत्यधिक राशि के साथ उपचार छोटे puromycilated polypeptides के अनुपात बढ़ जाती है और प्रोटियोलिसिस, जो आसानी से आम तौर पर होने वाली शोधों की घटनाओं की एक गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकता है उत्तेजित करने के लिए लगता है19 . अंगूठे का एक नियम के रूप में, अब मशीन समय, कम puromycin की जरूरत है, जबकि एक छोटी मशीन समय एक उच्च puromycin एकाग्रता की आवश्यकता है । एकाग्रता/समय विशेष प्रयोगात्मक सीमाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

यहां प्रस्तुत तरीके अत्यधिक अनुकूलनीय है और आसानी से लागू उपचार या जैविक प्रक्रिया का अध्ययन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है । Puromycin निगम समय की एक छोटी अवधि में अनुवाद कैनेटीक्स में परिवर्तन के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, जबकि ठहराव विधि सेलुलर घटनाओं के अत्यधिक जानकारीपूर्ण चित्र प्रदान करता है । हालांकि शक्तिशाली, इन पद्धतियों सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए है । Puromycin नए सभी mRNAs है कि सक्रिय रूप से अनुवाद कर रहे है से संश्लेषित प्रोटीन में शामिल किया जाएगा । इस कारण से, puromycilation विधि यहाँ वर्णित विशिष्ट लक्ष्यों (यानी, एकल mRNAs) का अध्ययन करने के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है, लेकिन यह एक एकल सेल या एक सेल जनसंख्या के भीतर शोधों गतिविधि का एक सामान्य अवलोकन प्राप्त करने के लिए आदर्श है. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, अत्यधिक puromycin बड़ी कमियां है, और puromycin खुराकों और उपचार के समय ध्यान से परिभाषित किया जाना चाहिए, के रूप में प्रोटोकॉल में प्रस्तावित । दरअसल, चित्रा 2में दिखाया गया है, अत्यधिक puromycin उपलब्धता छोटे puromycilated polypeptides के गठन में परिणाम होगा कि सेल में और अधिक तेजी से फैलाना, गलत उपसेलुलर स्थानीयकरण डेटा के लिए अग्रणी. इसके अतिरिक्त, बढ़ी हुई प्रोटियोलिसिस अत्यधिक puromycin उपचार के बाद होने के लिए जाना जाता है19, एक प्रभाव है कि संकेत का एक पूर्ण हानि में परिणाम हो सकता है ।

हालांकि क्लिक के रूप में विशिष्ट नहीं है, यह या चाल तरीकों, यहां प्रस्तावित दृष्टिकोण बहुत सुलभ है और अनुवाद कैनेटीक्स में सामांय परिवर्तन के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । यहां तक कि अगर अंय तरीकों बेहतर विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, puromycin निगमन परख एक पूरक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है । वास्तव में, अगर प्रयोग को दिखाने की जरूरत है कि एक विशिष्ट mRNA लक्ष्य केवल एक विशेष स्थिति में प्रभावित है, यह दिखाने के लिए कि यह अनुवाद में एक सामांय वृद्धि की वजह से नहीं है आवश्यक है । जैसे, नकारात्मक puromycin निगम इस मामले के लिए सबूत प्रदान कर सकता है । इसके अलावा, इस विधि अच्छी तरह से अनुवाद दरों में सामांय परिवर्तन देख के लिए अनुकूल है । इसलिए, यह एक अनुवाद दमन तंत्र को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में तनाव दाना गठन के मामले में9, या यदि cycloheximide अनुवाद परिसर आंशिक रूप से प्रारंभिक चरण में इस्तेमाल किया उपचार कुशलतापूर्वक अवरुद्ध है बढ़ाव22. यह भी उल्लेख है कि महत्वपूर्ण है, हालांकि ठहराव वर्गों २.३ में वर्णित तरीके और २.४ puromycin धुंधला पर ध्यान केंद्रित प्रयोगों से संबंधित है, वे fluorophores के विभिंन प्रकार का उपयोग दाग compartmentalized के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । दरअसल, इन ठहराव तरीकों के लिए एक अणु या प्रोटीन के सेलुलर वितरण यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है और यहां तक कि एक विशिष्ट उपसेलुलर डिब्बे में एक लक्ष्य के स्थानीयकरण मांय कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Dr. Rachid Mazroui (विश्विद्यालय लवल, Québec, कनाडा) का शुक्रिया अदा करते हैं । हम उनकी तकनीकी सहायता के लिए अनुसंधान केंद्र के सेल इमेजिंग इकाई को धन्यवाद देते हैं । एम.-É. Huot के शौकीनों de सूक्ष्म du Québec-Santé (FRQ-S) के एक जूनियर 1 अनुसंधान विद्वान है । इस कार्य को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (अनुदान संख्या CIHR, आरोग्य-२८६४३७ को एम.-É के द्वारा समर्थित किया गया. Huot) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM wisent 319-005-CL
Trypsine wisent 325-043 EL
FBS Thermo Fisher Scientific 12483020
Puroycin antibody 12D10 EMD millipore MABE343 western blot dilution 1:25,000
Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody cell signaling technology 7076 western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) cell signaling technology 4408 immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin biotium 00044 immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide Sigma C1988-1G 50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 final concentration 1µg/ml
Puromycin bio-Basic PJ593 2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat Ibidi 81156
MRC-5 cells ATCC CCL-171
HeLa cells ATCC CCL-2
Huh-7 cells from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000 olympus confocal imaging system
Fiji software http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline) bio-Basic PD8117
Formaldehyde 37% Solution bio-Basic C5300-1
Triton X-100 bio-Basic TB0198
BSA Fisher Bioreagents BP9702-100
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bergeman, J., Huot, M. É.… More

Bergeman, J., Huot, M. É. Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation. J. Vis. Exp. (126), e55909, doi:10.3791/55909 (2017).

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