في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات
Summary
ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule زراعة أسلوب يتيح تصوير خلية يعيش نبات زيجوتيس والأجنة. ويستخدم هذا الأسلوب لتصور ديناميات داخل الخلايا أثناء الاستقطاب الزيجوت وتحديد مصير الخلية في وضع الأجنة.
Abstract
في معظم النباتات المزهرة، الزيجوت والجنين مخفية في أعماق نسيج الأم، وهكذا منذ فترة طويلة كان لغزا لكيف تتطور بشكل حيوي؛ على سبيل المثال، كيف اقحه نمطين لإنشاء محور الجسم وكيف يحدد الجنين مصائر خلية مختلفة أثناء تكوين الجهاز. ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule ثقافة أسلوب القيام بتصوير خلية يعيش وضع zygotes والأجنة من نبات التمويل. المتوسط زراعة محسنة يسمح zygotes أو الأجنة في وقت مبكر أن تنمو لتصبح نباتات خصبة. عن طريق الجمع بين ذلك مع جهاز صفيف ميكروبيلار poly(dimethylsiloxane) (PDMS)، يعقد في ovule في المتوسطة السائل في نفس الموضع. هذا التثبيت أمر حاسم لمراقبة ovule نفسه تحت مجهر لعدة أيام من شعبة زيجوتيك إلى أواخر مرحلة الجنين. يمكن استخدام التصوير تعيش الخلية الناتجة لرصد ديناميات الاستقطاب الزيجوت، مثل الهجرة النووية وإعادة ترتيب سيتوسكيليتون، وأيضا توقيت انقسام الخلايا ومواصفات مصير الخلية أثناء الزخرفة الجنين في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يمكن دمج هذا النظام زراعة ovule مع العلاجات مثبط لتحليل آثار العوامل المختلفة على وضع الجنين والتلاعبات البصرية مثل انقطاع الليزر لدراسة دور خلية خلية الاتصال.
Introduction
خطة الهيئة الأساسية للكائن الحي يتطور من اقحه أحادي الخلية. في معظم النباتات المزهرة، يولد شعبة زيجوتيك قمي وخلية القاعدية، التي تتطور إلى تبادل لإطلاق النار والجذر، على التوالي1. ولذلك، من المهم أن نفهم كيف يتم تشكيل هيئة النبات أثناء امبريوجينيسيس، ولكن لم يكن هناك أداة فعالة لمراقبة ديناميات zygotes الحية والأجنة مباشرة نظراً لتطورها في أعماق الزهرة. في العديد من أنواع مونوكوت، مثل الذرة والأرز، وأسلوب إخصاب في الأنابيب قد المنشأة2،3. في هذا الأسلوب، عزل الحيوانات المنوية والخلايا البيض تنصهر فيها كهربائياً أو كيميائيا، والخلية التي تم إنشاؤها يمكن أن تتطور إلى مصنع خصبة. ومع ذلك، في مصانع ديكت، يوجد أي في المختبر التسميد أسلوب التي يمكن إنتاج أجنة سليمة، يفترض أنه بسبب حالة عدم مزامنة دورة الخلية الأمشاج الذكور والإناث4،5. وبالإضافة إلى ذلك، يلعب الأنسجة المحيطة بالجنين (السويداء) أدواراً هامة في تنمية الجنين6.
في أنواع ديكت نموذجي، ألف-التمويل، وضعت طريقة زراعة في المختبر بالتركيز على أبل كله، الذي يتضمن كلا من الجنين والسويداء7. استخدمت هذا النظام بنجاح تحليل آثار مختلف الكواشف الكيميائية على امبريوجينيسيس، ولكن أنها ليست مناسبة للوقت الفاصل بين التصوير لأنه يحتوي على معدل منخفض البقاء على قيد الحياة. ولذلك، تم وضع نظام زراعة ovule رواية في المختبر بغية البدء في أقرب وقت مرحلة الزيجوت، وإنتاج النباتات الخصبة في ارتفاع نسبة8. بعد محاكمات مختلفة، أنه تم العثور على تلك الوسيلة نيتش وتريهالوسي تحسن كبير في معدل البقاء على قيد الحياة من البويضات8. وبالإضافة إلى ذلك، لأنه توسع ovule كما أنها تنمو وهكذا كثيرا ما يتحرك بعيداً عن ميدان المراقبة المجهر، وضعت جهاز PDMS لإصلاح في أبل في المتوسط9. تمكين الجهاز PDMS تصوير طويلة الأجل لمدة 3-4 أيام، وكافية لتتبع التنمية من الزيجوت إلى جنينا قلب-مرحلة. باستخدام هذه الطريقة، يصبح من الممكن تصور ديناميات الاستقطاب الزيجوت والجنين الزخرفة، ليس فقط في ظل الظروف العادية، ولكن أيضا حضور مثبطات الكيميائية أو في مختلف الخلفيات متحولة8،10 ،11.
الشكل 1: رسم تخطيطي “علامات نيون المحددة” المستخدمة لتصور زيجوتيس والأجنة من خلال أوفولي.
اقحه نبات تتطور إلى جنين في أبل، التي يتم إنشاؤها داخل الزهرة. في هذا المختبر في زراعة النظام، لوحظت الزيجوت والجنين من خلال أبل، وبالتالي من المهم أن تستخدم علامات نيون المحددة التي لم يتم التعبير عن الأنسجة ovule الأخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
ويدخل هذه المخطوطة بسيطة في المختبر ovule زراعة بروتوكول فعال للاستخدام في تصوير خلية يعيش وضع zygotes والأجنة.
قد تحتاج إلى تصميم الجهاز PDMS الأمثل وفقا لمرحلة الجنين. كان الجهاز المتقدمة أول مجموعة ميكروكاجي لضبط الاتجاه وتحديد الموقف من البويضات9، وثم تم بناء…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أجريت في المعهد من تحويلي بيو-الجزيئات (WPI-إيتبم) من جامعة ناغويا مجهرية في هذا العمل وتدعمه “شبكة العلوم النباتية المتقدمة اليابان”. هذا العمل كان تدعمها المنح من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا (مشروع ايراتو T.H. وم) ومن “الجمعية اليابانية” “تعزيز العلوم”: معونات “البحث العلمي” في “مجالات مبتكرة” (غ. JP24113514، JP26113710، JP15H05962، و JP15H05955 م، ونص. JP16H06465 و JP16H06464 و JP16K21727 ل T.H)، معونات للعلماء الشباب (ب، غ. JP24770045 و JP26840093 م)، ومعونات “البحوث الاستكشافية” الصعبة (رقم JP16K14753 عن م).
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. . Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
