במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה
Summary
כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.
Abstract
רוב הצמחים פורחים, זיגוטה את ואת העובר מוסתרים עמוק בתוך רקמת אמא, ובכך כבר זמן רב המסתורין של איך הם מפתחים באופן דינאמי; לדוגמה, איך הזיגוטה קוטביות (ניגודים) להקים את ציר הגוף, איך העובר מציין הגורלות תא שונים במהלך היווצרות האיברים. כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית תרבות שיטה לבצע הדמיה לחיות תאים של פיתוח מופרות, העוברים של תודרנית לבנה. המדיום טיפוח ממוטבת מאפשר מופרות או עוברי מוקדם כדי לגדול לתוך צמחים פורייה. על ידי שילוב זה עם מכשיר מערך של micropillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS), ביצית מתקיים המדיום הנוזלי באותה תנוחה. הקיבעון הזה חיוני להתבונן באותה ביצית תחת מיקרוסקופ במשך מספר ימים ממחלקת zygotic לבמה העובר מאוחר. ההדמיה לחיות תאים וכתוצאה מכך ניתן לנטר את הדינמיקה בזמן אמת של קיטוב זיגוטה, כגון העברה גרעינית ו שחלוף שלד התא, וגם לעיתוי חלוקת התא תא מפרט הגורל במהלך העובר המתבנת. יתר על כן, שיטת הטיפוח הזאת ביצית יכול להיות משולב עם טיפולים מעכב כדי לנתח את השפעת גורמים שונים על התפתחות העובר, ועם מניפולציות אופטי כמו שיבוש לייזר כדי לבחון את תפקידה של תקשורת.
Introduction
התוכנית גוף בסיסי של אורגניזם מתפתח זיגוטה חד־תאיות. ברוב הצמחים פורחים, חטיבת zygotic מחוללת על הפסגה של התאים הבזליים, אשר לפתח לתוך לירות ואת שורש, בהתאמה1. לכן, חשוב להבין איך נוצר בגוף הצמח במהלך מופרה, אך לא היה כלי יעיל כדי לצפות ישירות את הדינמיקה של החיים מופרות, עוברי כי הם מפתחים עמוק בתוך הפרח. מספר מינים monocot, כגון תירס, אורז, שיטת הפריה במבחנה כבר הוקמה2,3. בשיטה זו, מבודד זרע ותאי ביצה הם התמזגו חשמלית או כימית, התא שנוצר יכול להתפתח צמח פורה. עם זאת, בצמחים dicot, יש אין במבחנה שיטת הדישון יכול לייצר עוברי תקין, ככל הנראה מפאת מצב בלתי-מסונכרנות מחזור התא של זכר ונקבה גמטות4,5. בנוסף, הרקמה שמסביב העובר (האנדוספרם) משחק תפקידים חשובים העובר פיתוח6.
במינים dicot מודל, לבנה א, שיטת טיפוח במבחנה פותחה על-ידי התמקדות כל ביצית, אשר מכיל העובר ואת האנדוספרם7. מערכת זו שימשה בהצלחה כדי לנתח את ההשפעות של ריאקטיבים כימיים שונים על מופרה, אבל היא לא מתאימה הדמיה בצילום מואץ כי יש לו סיכויי הישרדות נמוכה. לכן, הרומן במבחנה ביצית טיפוח מערכת פותחה על מנת להתחיל מוקדם ככל השלב זיגוטה ולייצר צמחים פורייה-יחס גבוה8. לאחר ניסויים שונים, זה היה למצוא אותה מדיום Nitsch, טרהלוז לשפר באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של ovules8. בנוסף, כי שלייה מתרחב כפי שהוא גדל ולכן לעתים קרובות יוצא מהשדה תצפית במיקרוסקופ, מכשיר PDMS פותחה כדי לתקן את ביצית ב בינוני9. המכשיר PDMS איפשרה ההדמיה לטווח ארוך 3-4 ימים, וזה מספיק כדי לעקוב אחר ההתפתחות זיגוטה העובר בשלב הלב. באמצעות שיטה זו, הוא הופך להיות אפשר לדמיין את הדינמיקה של קיטוב זיגוטה, העובר תכנים, לא רק בתנאים רגילים, אבל גם בנוכחות מעכבי כימי או שונים רקעים מוטציה8,10 ,11.
איור 1: תרשים סכמטי של הסמנים פלורסנט ספציפיים המשמשים מופרות באופן חזותי של עוברי דרך ביצית.
הזיגוטה תודרנית מתפתח העובר בתוך ביצית, אשר נוצר בתוך הפרח. ב במבחנה שיטת הטיפוח הזאת, זיגוטה את ואת העובר הם נצפו דרך להפרייה, ולכן חשוב להשתמש מסוים סמנים פלורסנט אינם מבוטאים ברקמות אחרות ביצית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מציג פשוט במבחנה ביצית טיפוח פרוטוקול זה יעיל לשימוש ההדמיה לחיות תאים של פיתוח מופרות עוברי.
העיצוב של המכשיר PDMS עשוי להזדקק אופטימיזציה לפי השלב העובר. המכשיר המפותח הראשון היה מערך microcage כדי להתאים את הכיוון וכדי לתקן את המיקום של ovules9ולאחר מכן…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מיקרוסקופ בעבודה זו נערך ב מכון של טרנספורמטיבי ביו-מולקולות (WPI-ITbM) של אוניברסיטת נאגויה ו נתמכת על ידי יפן מתקדמת צמח המדע רשת. עבודה זו נתמך על ידי מענקים של יפן ומדעי הטכנולוגיה סוכנות (ERATO פרוייקט תוצרת הארץ, M.U.) ומן החברה יפן הקידום של המדע: מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 ו JP15H05955 M.U., Nos. JP16H06465, JP16H06464 ו JP16K21727 עבור T.H), מענק הסיוע מדענים ומפתחים צעירים (B, Nos. JP24770045 ו JP26840093 עבור M.U.), ואת מענק של הסיוע למחקר גישוש מאתגר (מס ‘ JP16K14753 על M.U.).
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. . Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
