In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana
Summary
Este manuscrito descreve um in vitro ovule cultivo método que permite que a imagem latente da viver-pilha de Arabidopsis zigotos e embriões. Este método é utilizado para visualizar a dinâmica intracelular durante a polarização de zigoto e a especificação do destino de célula no desenvolvimento de embriões.
Abstract
Na maioria das plantas de floração, o zigoto e embrião estão ocultos no fundo do tecido da mãe, e assim tem sido um mistério de como eles desenvolvem dinamicamente; por exemplo, como o zigoto polariza para estabelecer o eixo do corpo e como o embrião especifica vários destinos de celular durante a formação do órgão. Este manuscrito descreve um in vitro ovule cultura método para executar a imagem latente da viver-pilha de desenvolver zigotos e embriões de Arabidopsis thaliana. O meio de cultivo otimizado permite zigotos ou embriões adiantados para crescer em plantas férteis. Combinando-a com um dispositivo de matriz de micropillar de poly(dimethylsiloxane) (PDMS), o óvulo é realizado em meio líquido na mesma posição. Essa fixação é fundamental observar o óvulo mesmo sob um microscópio para vários dias da extinta Divisão para a fase tardia do embrião. A imagem latente da viver-pilha resultante pode ser usado para monitorar a dinâmica em tempo real de polarização de zigoto, tais como migração nuclear e rearranjo do citoesqueleto e também o momento da divisão celular e especificação de destino célula durante a padronização do embrião. Além disso, este sistema de cultivo do ovule pode ser combinado com tratamentos de inibidor para analisar os efeitos de vários fatores no desenvolvimento do embrião e com ópticas manipulações tais como interrupção do laser para examinar o papel da comunicação célula-célula.
Introduction
O plano básico do corpo de um organismo se desenvolve a partir de um zigoto unicelular. Na maioria das plantas de floração, extinta Divisão gera uma apical e uma célula basal, que se desenvolvem na raiz, respectivamente1e atirar. Portanto, é importante entender como o corpo da planta é formado durante a embriogênese, mas lá não tem sido uma ferramenta eficaz para observar diretamente a dinâmica da vida zigotos e embriões porque eles desenvolvem no fundo da flor. Em diversas espécies de plantas, como milho e arroz, um método de fertilização em vitro tem sido estabelecida2,3. Neste método, isolado de esperma e os óvulos são fundidos eletricamente ou quimicamente, e a célula gerada pode evoluir para uma planta fértil. No entanto, em plantas de dicot, não há nenhum in vitro método de fertilização que pode produzir embriões adequados, presumivelmente por causa do estado do ciclo de pilha não-sincronizadas de gâmetas masculinos e femininos4,5. Além disso, o tecido circundante de embrião (endosperma) tem um papel importante no desenvolvimento de embrião6.
Em uma espécie de modelo dicot, a. thaliana, um método de cultivo em vitro foi desenvolvido focando o ovule inteiro, que contém o embrião e o endosperma7. Este sistema foi usado com sucesso para analisar os efeitos de vários reagentes químicos na embriogênese, mas não é adequado para imagens lapso de tempo, porque tem uma taxa de sobrevivência de baixo. Portanto, foi desenvolvido um sistema de cultivo de ovule romance em vitro para começar tão cedo quanto o estágio de zigoto e produzir plantas férteis em uma alta proporção de8. Depois de vários testes, verificou-se esse meio de Nitsch e trealose melhorou significativamente a taxa de sobrevivência de óvulos8. Além disso, porque o óvulo se expande à medida que cresce e, portanto, frequentemente se move longe do campo de observação do microscópio, um dispositivo PDMS foi desenvolvido para corrigir o ovule na média9. O dispositivo PDMS habilitado a imagem a longo prazo para 3-4 dias, que é suficiente para traçar o desenvolvimento de um zigoto de um embrião de coração-estágio. Usando esse método, torna-se possível visualizar a dinâmica da polarização de zigoto e embrião de padronização, não só em condições normais, mas também na presença de inibidores químicos ou em vários contextos mutantes8,10 ,11.
Figura 1: Diagrama esquemático dos marcadores fluorescentes específicos usados para visualizar zigotos e embriões através do Ovule.
O Arabidopsis zigoto se desenvolve em um embrião no óvulo, que é gerado no fundo da flor. Neste sistema cultivo em vitro , o zigoto e embrião são observados através do ovule e, portanto, é importante o uso de marcadores fluorescentes específicos que não são expressas em outros tecidos do óvulo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito introduz um simples em vitro ovule cultivo protocolo que é eficiente para uso na imagem ao vivo-célula de desenvolvimento de zigotos e embriões.
O design do aparelho PDMS pode precisar de otimização de acordo com a fase de embrião. O primeiro dispositivo desenvolvido era uma matriz de microcage para ajustar a orientação e para corrigir a posição dos óvulos9, e em seguida um dispositivo de micropillar foi construído para interceptar ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microscopia neste trabalho foi realizada no Instituto de transformadora Bio-moléculas (WPI-ITbM) da Universidade de Nagoya e suportada pelo Japão avançado Plant Science Network. Este trabalho foi financiado por doações do Japão de ciência e tecnologia agência (projeto ERATO T.H. e Magal) e da sociedade do Japão para a promoção da ciência: um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (n º s. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 e JP15H05955 para Magal e n º s. JP16H06465, JP16H06464 e JP16K21727 para Silvia), um subsídio para jovens cientistas (B, n º s. JP24770045 e JP26840093 para Magal) e um subsídio para pesquisa exploratória desafiador (n. º JP16K14753 para Magal).
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
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