والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]
Summary
ميليناتينج oligodendrocytes تعزيز النشر السريع العمل المحتملة وبقاء الخلايا العصبية. بروتوكول للتعبير أوليجوديندروسيتي محددة من البروتينات الفلورية في أورجانوتيبيك شرائح المخ بتصوير مرور الزمن اللاحقة الموضحة هنا. علاوة على ذلك، يرد إجراء بسيط لتصور المايلين أونستينيد.
Abstract
الخلايا العصبية تعتمد على العزل الكهربائي، والدعم التغذوي من أوليجوديندروسيتيس ميليناتينج. وعلى الرغم من أهمية oligodendrocytes، الأدوات المتقدمة المستخدمة حاليا بدراسة الخلايا العصبية، جزئيا فقط قد اتخذت على الباحثين أوليجوديندروسيتي. خلية تلطيخ بتوصيل الفيروسي نوع معين نهجاً مفيداً لدراسة ديناميات عضية حية. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لتصور oligodendrocyte الميتوكوندريا في شرائح المخ أورجانوتيبيك بتوصيل مع الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) يحمل جينات المتقدرية البروتينات الفلورية المستهدفة تحت سيطرة النسخي مروج البروتين الأساسية المايلين. ويشمل البروتوكول لصنع أورجانوتيبيك شرائح المخ الماوس الاكليلية. ويتبع إجراء لتصوير الوقت الفاصل بين الميتوكوندريا ثم. هذه الطرق يمكن نقلها إلى العضيات الأخرى، وقد تكون مفيدة بشكل خاص لدراسة العضيات في غمد المايلين. وأخيراً، يصف لنا تقنية متاحة بسهولة لتصور المايلين أونستينيد في معيشة الشرائح بالانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية). الأساسية يتطلب أي معدات إضافية، ويمكن أن تكون مفيدة لتحديد غمد المايلين أثناء التصوير الحي.
Introduction
المسألة الأبيض في الدماغ تتكون من محاور الخلايا العصبية عصبية ملفوفة في المايلين، غشاء البلازما موسعة متخصصة التي شكلتها oligodendrocytes. المايلين المطلوب لنشر سريعة وموثوق بها من إمكانات العمل والبقاء الطويل الأجل لمحاور عصبية myelinated، ويمكن أن يسبب خسارة في المايلين الخلل في الجهاز العصبي. على الرغم من أهميتها، خصائص oligodendrocytes أقل شهرة مقارنة مع الخلايا العصبية وأستروسيتيس. ونتيجة لذلك، استحدثت أدوات أقل لدراسة أوليجوديندروسيتيس.
ويعيش تصوير العضيات في الخلية مثل الميتوكوندريا والشبكة اندوبلاسماتيك (ER) أو هياكل حويصلية مختلفة يمكن أن يكون مفيداً لدراسة التغيرات الدينامية في العضيات مرور الوقت. تقليديا، قد أنجز تصوير أوليجوديندروسيتيس الذين يعيشون في الزراعات الأحادية1،2. ومع ذلك، oligodendrocytes في الأحادية لا تقم بعرض الاتفاق المايلين، وأورجانوتيبيك أو شرائح الدماغ الحادة، ولذلك، يكون خيار أفضل عند دراسة التعريب وحركة العضيات. يمكن أن يكون التعريب العضيات الصغيرة والبروتينات في غمد المايلين تحديا نظراً لبعد المسافة القصيرة بين إكسون myelinated وغمد المايلين المحيطة بها. وهكذا، إجراءات إيمونوستينينج المجهري الخفيفة وحدها لا تملك القرار المكانية تميز بين العضيات في غمد المايلين وتلك الموجودة في محور عصبي ميليناتيد. وهذا يمكن حلها بواسطة توصيل الفيروسية مع الجينات للبروتينات الفلورية استهدفت عضية مدفوعا بالخلية المحددة بنوع المروجين. المزايا هي تعبير خلية على حدة ومتفرق، التي تمكن من تقييم دقيق للتعريب عضية والديناميات. يمكن أيضا استخدام الحيوانات المحورة وراثيا لتحقيق مثل هذا تعبير الخاصة بالخلية المستهدفة عضية3. ومع ذلك، إنتاج وصيانة الحيوانات المحورة وراثيا مكلفة ولا تقدم عادة متفرق التعبير الذي يمكن تحقيقه بأساليب الفيروسية.
يستخدم الأسلوب الموصوفة هنا توصيل الفيروسية من أوليجوديندروسيتيس مع البروتينات الفلورية المتقدرية المستهدفة (دسريد أو أخضر نيون البروتين، التجارة والنقل) مدفوعا بالمروج البروتين الأساسية المايلين (MBP-ميتو-دسريد أو MBP-ميتو-التجارة والنقل) تصور أوليجوديندروسيتي الميتوكوندريا في شرائح المخ أورجانوتيبيك. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم تعبير آخر بروتين فلوري في السيتوبلازم (بروتينات فلورية خضراء تستخدم جنبا إلى جنب مع ميتو دسريد أو تدتوماتو المستخدمة مع ميتو-التجارة والنقل) لتمكين التصور مورفولوجيا الخلايا، بما في ذلك المقصورات هيولى من غمد المايلين. ويشمل البروتوكول الإجراء لجعل شرائح المخ أورجانوتيبيك (نسخة معدلة من البروتوكول التي وصفها دي سيموني ويو، 20064،5). ثم يصف لنا الوقت الفاصل بين إجراء التصوير دراسة حركة المتقدرية. يستخدم هذا الإجراء مجهر [كنفوكل] تستقيم مع تبادل مستمر للتصوير المتوسطة، إعداد التي تمكن سهلة التطبيق للمخدرات أو غيرها من التغييرات متوسطة أثناء التصوير. الوقت الفاصل بين التصوير يمكن إجراء على أي مجهر [كنفوكل]، مع بعض المعدات الإضافية للحفاظ على معيشة الشرائح كما هو موضح أدناه. ويتضمن البروتوكول أيضا العديد من النصائح لتحسين التصوير والحد من الضيائية.
وأخيراً، يرد وصف لطريقة سريعة وبسيطة لتصور المايلين أونستينيد طريق الانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية). وهذا يمكن أن تكون مفيدة لتحديد غمد المايلين أثناء التصوير الحي. في السنوات الأخيرة، تم تطوير العديد من التقنيات المايلين الصورة دون أي تلطيخ المطلوبة، ولكن معظم هذه تتطلب محددة المعدات والخبرة6،،من78. الإجراء الموضح هنا يستخدم الخصائص الانعكاسية غمد المايلين، وهو نسخة مبسطة للطول موجي الإثارة واحدة من “الانعكاس [كنفوكل] طيفية” مجهرية (يتم الجمع بين نقاط، والذي عدة الليزر الأطوال الموجية لتصور المايلين) 9-الأساسية يمكن القيام به على أي مجهر [كنفوكل] يحتوي 488 نانومتر ليزر و 470-500 نانومتر ممر الموجه مرشح انبعاثات أو عامل تصفية انبعاثات الانضباطي.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المتعلق بجعل الثقافات أورجانوتيبيك الموصوفة هنا هو نسخة معدلة18 بروتوكول وصف سيموني دي ويو (2006)5. وقد أوجزت أهم التغييرات أدناه. يتم إضافة تريس المخزن المؤقت إلى متوسط الثقافة، مما يحسن من بقاء الشرائح عند خارج الحاضنة أثناء توصيل الفيروسية وتغيير الوس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ليندا هايدغارد بيرجيرسين ومنير Bjørås للوصول الخلية المختبرات والمعدات و “الموارد المشتركة البيولوجيا الجزيئية جانيليا” الموظفين بلازميد وإنتاج الفيروس وستحدده كوين للمساعدة مع قياسات الطاقة الليزر. تم تمويل هذا العمل من قبل “جمعية الصحة النرويجية”، مجلس البحوث النرويجي ومعدات الفحص المجهري وقد مولت نوربرين.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
