والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

ملخص

ميليناتينج oligodendrocytes تعزيز النشر السريع العمل المحتملة وبقاء الخلايا العصبية. بروتوكول للتعبير أوليجوديندروسيتي محددة من البروتينات الفلورية في أورجانوتيبيك شرائح المخ بتصوير مرور الزمن اللاحقة الموضحة هنا. علاوة على ذلك، يرد إجراء بسيط لتصور المايلين أونستينيد.

الملخص

الخلايا العصبية تعتمد على العزل الكهربائي، والدعم التغذوي من أوليجوديندروسيتيس ميليناتينج. وعلى الرغم من أهمية oligodendrocytes، الأدوات المتقدمة المستخدمة حاليا بدراسة الخلايا العصبية، جزئيا فقط قد اتخذت على الباحثين أوليجوديندروسيتي. خلية تلطيخ بتوصيل الفيروسي نوع معين نهجاً مفيداً لدراسة ديناميات عضية حية. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لتصور oligodendrocyte الميتوكوندريا في شرائح المخ أورجانوتيبيك بتوصيل مع الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) يحمل جينات المتقدرية البروتينات الفلورية المستهدفة تحت سيطرة النسخي مروج البروتين الأساسية المايلين. ويشمل البروتوكول لصنع أورجانوتيبيك شرائح المخ الماوس الاكليلية. ويتبع إجراء لتصوير الوقت الفاصل بين الميتوكوندريا ثم. هذه الطرق يمكن نقلها إلى العضيات الأخرى، وقد تكون مفيدة بشكل خاص لدراسة العضيات في غمد المايلين. وأخيراً، يصف لنا تقنية متاحة بسهولة لتصور المايلين أونستينيد في معيشة الشرائح بالانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية). الأساسية يتطلب أي معدات إضافية، ويمكن أن تكون مفيدة لتحديد غمد المايلين أثناء التصوير الحي.

المقدمة

المسألة الأبيض في الدماغ تتكون من محاور الخلايا العصبية عصبية ملفوفة في المايلين، غشاء البلازما موسعة متخصصة التي شكلتها oligodendrocytes. المايلين المطلوب لنشر سريعة وموثوق بها من إمكانات العمل والبقاء الطويل الأجل لمحاور عصبية myelinated، ويمكن أن يسبب خسارة في المايلين الخلل في الجهاز العصبي. على الرغم من أهميتها، خصائص oligodendrocytes أقل شهرة مقارنة مع الخلايا العصبية وأستروسيتيس. ونتيجة لذلك، استحدثت أدوات أقل لدراسة أوليجوديندروسيتيس.

ويعيش تصوير العضيات في الخلية مثل الميتوكوندريا والشبكة اندوبلاسماتيك (ER) أو هياكل حويصلية مختلفة يمكن أن يكون مفيداً لدراسة التغيرات الدينامية في العضيات مرور الوقت. تقليديا، قد أنجز تصوير أوليجوديند....

البروتوكول

الإجراءات المذكورة هنا أن تقرها "هيئة بحوث الحيوان النرويجية". الموردين وإعداد النشرة المصورة للمواد الاستهلاكية وغيرها تتطلب معدات متوفرة في قائمة المواد في نهاية المستند.

1. "إعداد شرائح أورجانوتيبيك"

ملاحظة: تستخدم هذه الوصفة اثنين الماوس الجراء عند الولادة يوم 7-9 (p7-9)، مما يسفر عن 24 أورجانوتيبيك شرائح مقسمة على اثنين ستة آبار ثقافة الأطباق. ما لم ينص على خلاف ذلك، ينبغي القيام بجميع الإجراءات بغطاء معقم ويجب استخدام قفازات نيتريل أو المطاط. ينبغي أن تستخدم المكونات الصف ثقافة الخلية فقط.

1. زجاجات اﻷوتوكﻻف، أدوات تشريح (1 مقص كبير ومقص صغير 1, 1 ملعقة مسطحة كبيرة، 1 ملعقة صغيرة مدورة وشحذ والملق....

النتائج

شرائح المخ أورجانوتيبيك مثقف وترانسدوسيد كما هو موضح أعلاه تبين توزيع oligodendrocytes القشرية الإعراب عن mito_dsred والتجارة والنقل بصورة متفرقة. إيمونوستاينينج مع الأجسام المضادة ضد Olig2 و MBP أكدت أن التعبير معين إلى oligodendrocytes (الشكل 1).

لتصوير حية، اعترف بهم مورفولوجيا مميزة من عدة اﻷغماد المايلين التي تعمل على التوازي (الشكل 1 و الشكل 2.......

المناقشة

البروتوكول المتعلق بجعل الثقافات أورجانوتيبيك الموصوفة هنا هو نسخة معدلة¹⁸ بروتوكول وصف سيموني دي ويو (2006)⁵. وقد أوجزت أهم التغييرات أدناه. يتم إضافة تريس المخزن المؤقت إلى متوسط الثقافة، مما يحسن من بقاء الشرائح عند خارج الحاضنة أثناء توصيل الفيروسية وتغيير الوسط الخلية. يتم أيضا تغيير إجراءات التعقيم قصاصات من الورق. بينما البروتوكولات الأخرى تعقيم حلويات بالتعقيم، نحن لا ننصح بذلك لأنه سوف يسبب العديد من قصاصات ورق تجعيد. تجنب استخدام قصاصات ورق الكروشيه شرائح نمت هذه .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agarose	سيجما	A9539
BD Microlance 19G	BD	301500	الإبر المستخدمة في داخل ومخرج
غاز ثاني أكسيد	الحمام AGA	105701
لمبات ماصة العلامة التجارية	لمبات الماصة Sigma-Aldrich	Z615927	ماصة
موقد بنسن (موقد البروبان السائل)	VWR	89038-530
تجميع الكابلات لأجهزة التحكم في السخان	Warner Instruments	64-0106	جهاز التحكم في درجة الحرارة - جزء مقياس الحرارة
CaCl2	Fluka	21100
CO2	AGA	100309	CO2< / sub> للحاضنة
غطاء الزجاج ، مربع Corning	Thermo   ؛ 13206778 فيشر العلمي		لإرفاقه تحت الحمام للتصوير الحي. ختم بالغراء أو هلام البنزين.
D- (+) - الجلوكوز	Sigma	G7021
ملقط دقيق	Finescience	11063-07	لتشريح
قلم كاتب الماس	Ted Pella Inc.	54463
ماصات باستور زجاجية يمكن التخلص منها 230 مم	VWR	612-1702	ماصات زجاجية شفرة
حلاقة مزدوجة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ	علوم المجهر الإلكتروني	# 7200	شفرة حلاقة للاهتزاز
محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS)	Gibco-Invitrogen	24010-043
دوائر ورق الترشيح	Schleicher & amp Schuell	300،220	ورق الترشيح المستخدم لترشيح PFA
Fun tack	Loctite	1270884	يستخدم لتوصيل / ضبط موضع المداخل والمنافذ في منشفة اليد
C-Fold 2	Katrin	344388
Harp ، مسطحة لغرفة RC-41 ،	Warner Instruments	؛ 64-1418	القيثارة لتثبيت قصاصات الورق في الحمام. قطع الخيوط قبل الاستخدام مع شرائح عضوية. 1.5 مم ، 13 مم ، SHD-41/15
HEPES ، FW: 260.3	Sigma	H-7006
Holten LaminAir ، نموذج 1.2	Heto-Holten	96004000M	غطاء محرك السيارة التدفق الصفحي
مصل الحصان ، معطل بالحرارة	Gibco-Invitrogen	26050-088
KCl	Sigma	P9541
غشاء LCR ، PTFE ،   ؛	Millipore	FHLC0130	قصاصات ورقية   ؛
Leica VT1200	Leica	14048142065	Vibratome
MEM-Glutamax مع HEPES	Thermo   ؛ Fischer Scientific	42360024
MgCl2< / sub>	R.P. Normapur	25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B	علوم المجهر الإلكتروني	62411-B	صغيرة مستديرة بنهاية حادة للتشريح
وحدة مرشح Millex-GP Millipore		SLGPM33RA	وحدة تصفية حقنة
إدراج ثقافة الخلايا المليسيلية ، 30 مم	Millipore	PICM03050	إدراج ثقافة الخلايا
وحدة التحكم في السرعة Minipuls 3 مضخة	GILSON	F155001	للتصوير المباشر - جزء وحدة التحكم (قم بتوصيله برأس ثنائي الكانيل)
Na 2< / sub >HPO4< / sub>	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2< / sub>PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaHCO3	Fluka	71628
Nunclon Delta Surface	Thermo  لوحة ثقافة 140675 فيشر
العلمية تعليق النيستاتين	سيجما-ألدريتش	N1638
الهدف W "Plan-Apochromat" 40x / 1.0 DIC & nbsp ؛	زايس	441452-9900-000	هدف الغمر في الماء يستخدم للتصوير الحي. (WD = 2.5 مم) ، VIS-IR
Parafilm	VWR	291-1211
Paraformaldehyde ،	علوم المجهر الإلكتروني	# 19208
PC-R غرفة التروية	SiSkiYou	؛ 15280000E	حمام للتصوير المباشر
البنسلين الستربتومايسين ، سائل	Invitrogen	15070-063
طبق بتري 140 مم   ؛	طبق بتري كبير Heger	1075
طبق بتري 92x16 مم	Sarstedt	82.1473	طبق بتري متوسط
Petridish 55x14,2 مم	VWR	391-0868	طبق بتري صغير
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أقراص	Sigma	P4417	PBS
R2 رأس قناتين   ؛	GILSON	F117800	مضخة تمعجية للتصوير المباشر - جزء رأس قناتين (يتطلب وحدة تحكم)
ملاعق مستديرة / مسطحة ، ستانلس	VWR	82027-528	ملعقة كبيرة لتشريح
ورق الرمل	VWR	MMMA63119	اختياري ، لتنعيم الماصات الزجاجية المكسورة
مقص ،  17,5 سم	Finescience	14130-17	مقص كبير للتشريح
مقص ، 8،5   ؛	Finescience	14084-08	مقص صغير حاد ل   تشريح
حافة واحدة ، شفرة أحجار كريمة	علوم المجهر الإلكتروني	# 71972	شفرة حلاقة أحادية الحافة
سخان حل مضمن واحد SH-27B	Warner Instruments	64-0102	جهاز التحكم في درجة الحرارة - جزء السخان
وحدة تصفية Steritop-GP ، 500 مل ، 45 مم	مرشح SCGPT05RE Millipore		للتعقيم حلول
فائقة الغراء دقة	Loctite	1577386
شفرة مشرط جراحية رقم 22	Swann Morton Ltd.	209	شفرة مشرط مستديرة
وحدة تحكم في درجة الحرارة TC324B	Warner Instruments	64-0100	وحدة تحكم في درجة الحرارة للتصوير المباشر (تتطلب سخان الحل وتجميع الكابلات)
Trizma	Sigma & nbsp ؛	T1503
Trizma HCl	Sigma	T3253
حاضنة مغلفة بالماء سلسلة II	حاضنة	فورما العلمية	78653-2882

ملعقة التمعج الحبيبي ستيل قاعدة