Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme
Summary
Myelinating oligodendrocytes hızlı aksiyon potansiyeli yayılması ve nöronal hayatta kalma teşvik. Burada açıklanan bir oligodendrocyte özel mesaj organotypic floresan proteinlerin beyin dilimleri ile sonraki zaman hata görüntüleme iletişim kuralıdır. Ayrıca, günahı miyelin görüntülenmesi için basit bir prosedür sunulur.
Abstract
Nöronlar elektrik izolasyon ve myelinating oligodendrocytes trofik desteğiyle güveniyor. Önemini oligodendrocytes rağmen şu anda nöronlar, eğitim için kullanılan gelişmiş araçlar yalnızca kısmen atılmıştır oligodendrocyte araştırmacılar tarafından. Hücre türüne özgü tarafından viral iletim boyama canlı organel dynamics eğitim için yararlı bir yaklaşımdır. Bu kağıt ile adeno ilişkili virüs (AAV) transkripsiyon kontrolü altında mitokondrial hedeflenen floresan proteinler için gen taşıyan iletim tarafından oligodendrocyte mitokondri organotypic beyin dilimleri içinde görüntülenmesi için bir iletişim kuralı açıklar miyelin temel protein organizatörü. Koronal fare beyin dilimler organotypic yapmak için iletişim kuralı içerir. Bir yordam için hızlandırılmış düşsel mitokondri, sonra arkasından gelir. Bu yöntem diğer organelleri için transfer edilebilir ve organelleri miyelin kılıf içinde çalışmak için özellikle yararlı olabilir. Son olarak, Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından yaşam dilimleri içinde günahı miyelin görselleştirme için hazır bir tekniği tarif. Çekirdek hiçbir ekstra ekipman gerektirir ve canlı görüntüleme sırasında miyelin kılıf tanımlamak yararlı olabilir.
Introduction
Beynin beyaz madde sinir hücresi aksonlar miyelin, oligodendrocytes tarafından kurulan özel bir genişletilmiş plazma zarı sarılı oluşur. Miyelin hızlı ve güvenilir aksiyon potansiyeli yayılması ve myelinated akson uzun vadeli yaşam için gereklidir ve nörolojik disfonksiyon miyelin kaybına neden olabilir. Önemine rağmen oligodendrocytes özelliklerini daha az bilinen neurons ve astrocytes ile karşılaştırılır. Sonuç olarak, daha az araçları oligodendrocytes eğitimi için geliştirilmiştir.
Mitokondri, endoplasmatic retikulum (ER) veya farklı veziküler yapıları organelleri dinamik değişiklikleri zaman içinde eğitim yararlı olabilir gibi hücre organelleri görüntüleme yaşıyor. Geleneksel olarak, oturma oligodendrocytes görüntüleme monocultures1,2‘ gerçekleştirdi. Ancak, Monokültür oligodendrocytes kompakt miyelin görüntülenmez ve organotypic veya akut beyin dilimleri bu nedenle, daha iyi bir seçenek Yerelleştirme ve organelleri hareketin okurken olabilir. Yerelleştirme küçük organelleri ve miyelin kılıf protein myelinated akson ve çevresindeki miyelin kılıf arasında kısa bir mesafe nedeniyle zor olabilir. Böylece, ışık mikroskopik immunostaining yordamlar yalnız organelleri miyelin kılıf içinde ve bu myelinated akson arasında ayırımcılık Uzaysal çözünürlük var mı. Bu viral iletim flüoresan proteinler organel hedef hücre türüne özgü rehberleri tarafından tahrik için genleri olan tarafından çözülebilir. Avantajları dinamiği ve organel yerelleştirme doğru değerlendirme sağlar bir hücre özgü ve seyrek ifade vardır. Transjenik hayvanlar böyle bir hücre özgü ifade organel hedefli3elde etmek için de kullanılabilir. Ancak, üretim ve bakım Transjenik hayvanlar, pahalı ve genellikle viral yöntemlerle elde edilebilir seyrek ifade sunmuyor.
Yöntem tanımlamak burada miyelin temel protein düzenleyici tarafından (MBP-mito-dsred veya MBP-mito-GFP) görselleştirmek için tahrik oligodendrocytes floresan proteinler (dsred veya yeşil flüoresan protein, GFP) mitokondriyal hedefli ile viral iletim kullanır organotypic beyin dilimleri içinde oligodendrocyte mitokondri. Buna ek olarak, ifade (mito-dsred ile birlikte kullanılan GFP veya mito-GFP ile kullanılan tdtomato) sitoplazmada başka bir floresan proteinin hücre morfolojisi, miyelin kılıf sitoplazmik bölümler de dahil olmak üzere görselleştirme etkinleştirmek için kullanılır. Protokol organotypic beyin dilimleri (De Simoni ve Yu, 20064,5tarafından açıklanan protokol değiştirilmiş bir sürümü) yapmak için yordam içerir. Biz o zaman mitokondrial hareketi eğitim için hızlandırılmış görüntüleme açıklayınız. Bu yordam, sürekli bir değişim görüntüleme orta, uyuşturucu veya diğer Orta değişiklikleri görüntüleme sırasında uygulama kolaylığı sağlar bir kurulum ile dik bir confocal mikroskop kullanır. Hızlandırılmış görüntüleme yordam confocal herhangi bir mikroskopla aşağıda açıklandığı gibi yaşam dilimleri korumak için bazı ekstra ekipman üzerinde gerçekleştirilebilir. Protokol Ayrıca görüntüleme optimize etmek ve fototoksisite azaltmak için birkaç ipucu içerir.
Son olarak, günahı miyelin Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından görselleştirmek için hızlı ve basit bir şekilde açıklanmıştır. Bu miyelin kılıf canlı görüntüleme sırasında tanımlamak yararlı olabilir. Son yıllarda, gerekli herhangi bir boyama olmadan görüntü miyelin için çeşitli teknikler geliştirilmiştir, ancak bunların çoğu özel ekipman ve uzmanlık6,7,8gerektirir. Burada açıklanan yordamı kullanır miyelin kılıf yansıtıcı özellikleri ve spektral Confocal yansıma mikroskobu Basitleştirilmiş tek-uyarma dalga boyu sürümüdür (skor, içinde birkaç lazer dalga boyu miyelin görselleştirmek için birleştirilir) 9. çekirdek 488 nm lazer ve 470-500 nm bant emisyon filtre veya bir akort emisyon filtre vardır herhangi bir confocal mikroskobunun yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan organotypic kültürler yapmak için De Simoni ve Yu (2006)5tarafından açıklanan Protokolü’nün bir anlam değiştirici yorum18 iletişim kuralıdır. En önemli değişiklikler aşağıda açıklanan olmuştur. Tris arabellek dilimleri dışında da kuluçka viral iletim sırasında yaşama ve hücre orta değiştirerek geliştirir kültür ortamına eklenir. Sterilizasyon yordam konfeti için de değiştirilir. Diğer protokoller konfeti tarafından…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Linda Hildegard Bergersen ve Magnar Bjørås erişim için laboratuar ve donanımları, plazmid ve virüs üretim için Janelia moleküler biyoloji paylaşılan kaynak personel ve Koen Vervaeke lazer gücü ölçümleri hakkında yardım almak için hücre için teşekkür ederim. Bu eser Norveç sağlığı Derneği, Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi ve mikroskopi ekipman Norbrain tarafından finanse edildi.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
