Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie
Summary
Myelinating oligodendrocyten bevorderen snelle actiepotentiaal propagatie en neuronale overleving. Hier beschreven is een protocol voor Oligodendrocyt-specifieke expressie van fluorescente proteïnen in organotypic hersenen segmenten met latere time-lapse beeldvorming. Verder is wordt een eenvoudige procedure voor het visualiseren van onbevlekt myeline gepresenteerd.
Abstract
Neuronen zijn, is afhankelijk van de elektrische isolatie en trofische steun van myelinating oligodendrocyten. Ondanks het belang van de oligodendrocyten, zijn de geavanceerde hulpmiddelen die momenteel gebruikt voor het bestuderen van neuronen, slechts gedeeltelijk gezet op door Oligodendrocyt onderzoekers. Cel type-specifieke kleuring door virale transductie is handig om te studeren live organel dynamiek. Dit witboek beschrijft een protocol voor het visualiseren van Oligodendrocyt mitochondriën in organotypic hersenen plakjes door transductie met adeno-associated virus (AAV) uitvoering van genen voor mitochondriale gerichte fluorescerende eiwitten onder de Transcriptionele controle van de myeline fundamentele eiwit promotor. Het bevat het protocol voor het maken van organotypic coronale muis hersenen segmenten. Een procedure voor time-lapse beeldvorming van mitochondriën dan volgt. Deze methoden kunnen worden overgedragen aan andere organellen en kunnen bijzonder nuttig zijn voor de studie van de organellen in de myelineschede. Ten slotte, beschrijven we een gemakkelijk beschikbare techniek voor visualisatie van onbevlekt myeline in levende segmenten door reflectie van de Confocal Microscopie (CoRe). Kern vereist geen extra apparatuur en nuttig kan zijn voor het identificeren van de myelineschede tijdens live imaging.
Introduction
Van de hersenen witte stof bestaat uit zenuwcel axonen verpakt in myeline, een gespecialiseerde uitgebreide plasmamembraan gevormd door oligodendrocyten. Myeline is vereist voor snelle en betrouwbare actiepotentiaal propagatie en voortbestaan van myelinated axonen, en een verlies van myeline neurologische stoornissen kan veroorzaken. Ondanks hun belang, worden de eigenschappen van de oligodendrocyten minder gekend vergeleken met neuronen en astrocyten. Bijgevolg zijn minder gereedschappen ontwikkeld voor het bestuderen van de oligodendrocyten.
Live beeldvorming van cel organellen, zoals mitochondriën, endoplasmatic reticulum (ER) of verschillende vesiculaire structuren kunnen nuttig zijn te onderzoeken van dynamische veranderingen in de organellen na verloop van tijd. Beeldvorming van levende oligodendrocyten is traditioneel, uitgevoerd in monoculturen1,2. Echter oligodendrocyten in monocultuur compacte myeline niet weergegeven, en organotypic of acute hersenen segmenten, dus wellicht een betere optie bij de studie van de lokalisatie en verkeer van organellen. Lokalisatie van kleine organellen en eiwitten in de myelineschede kan worden uitdagend vanwege de korte afstand tussen de myelinated axon en de omliggende myelineschede. Licht microscopische immunokleuring procedures alleen hoeft dus niet de ruimtelijke resolutie te discrimineren tussen organellen in de myelineschede en die in de myelinated axon. Dit kan worden opgelost door virale transductie met genen voor organel-gerichte fluorescente proteïnen gedreven door cel type-specifieke initiatiefnemers. De voordelen zijn een schaars en cel-specifieke expressie, waardoor accurate beoordeling van organel lokalisatie en dynamiek. Transgene dieren kunnen ook worden gebruikt om dergelijke een organel-gerichte cel-specifieke expression3. Echter, de productie en het onderhoud van transgene dieren is duur en bieden meestal niet de schaars expressie die kan worden bereikt door virale methoden.
De beschreven methode gebruikt hier virale transductie van oligodendrocyten met fluorescerende eiwitten mitochondriaal-gerichte (dsred of groen fluorescent protein, GFP) gedreven door de promotor van myeline basic protein (MBP-mito-dsred of MBP-mito-GFP) te visualiseren Oligodendrocyt mitochondriën in organotypic hersenen plakjes. Bovendien wordt expressie van een ander fluorescent proteïne in het cytoplasma (GFP gebruikt in combinatie met mito-dsred of tdtomato gebruikt met mito-GFP) gebruikt om de visualisatie van de morfologie van de cel, met inbegrip van de cytoplasmatische compartimenten van de myelineschede. Het protocol bevat de procedure voor het maken van organotypic hersenen segmenten (een gemodificeerde versie van het protocol beschreven door De Simoni en Yu, 20064,5). Vervolgens beschrijven we de time-lapse imaging procedure voor het bestuderen van mitochondriale beweging. Deze procedure maakt gebruik van een rechtop confocal microscoop met een voortdurende uitwisseling van imaging medium, een setup waarmee de gemakkelijke toepassing van drugs of andere middellange wijzigingen tijdens imaging. De time-lapse imaging procedure kan worden uitgevoerd op elke confocal microscoop, met wat extra apparatuur voor het behoud van levende segmenten zoals hieronder beschreven. Het protocol bevat ook verschillende tips om optimaliseren van beeldvorming en verminderen van fototoxiciteit.
Tot slot, een snelle en eenvoudige manier om te visualiseren onbevlekt myeline door reflectie van de Confocal Microscopie (CoRe) wordt beschreven. Dit kan zinvol zijn om te identificeren van de myelineschede tijdens live imaging. In de afgelopen jaren verschillende technieken zijn ontwikkeld om de afbeelding myeline zonder enige kleuring vereist, maar de meeste van deze vereisen specifieke apparatuur en expertise6,7,–8. De hier beschreven procedure maakt gebruik van de reflectie-eigenschappen van de myelineschede en is een vereenvoudigde single-excitatie golflengte versie van de reflectiecoëfficiënt van spectrale Confocal Microscopie (SCoRe, waarin verschillende golflengten laser worden gecombineerd om te visualiseren van myeline) 9. kern kan gebeuren op elke confocal microscoop met een 488 nm laser en een 470-500 nm bandpass emissie filter of een afstembare emissie-filter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol voor het maken van organotypic culturen hier beschreven is een gewijzigde versie18 van het protocol beschreven door De Simoni en Yu (2006)5. De belangrijkste wijzigingen hebben zijn hieronder. Tris-buffer wordt toegevoegd aan het kweekmedium, waardoor het voortbestaan van de segmenten als buiten de incubator tijdens virale transductie en wijzigen van de cel-medium worden verbeterd. De sterilisatie procedure voor confetti is ook veranderd. Terwijl andere protoco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Linda Hildegard Bergersen en Magnar Bjørås voor toegang naar cel lab en apparatuur, Janelia moleculaire biologie gedeelde Resource personeel voor plasmide en virus productie als Koen Vervaeke voor hulp bij laser macht metingen. Dit werk werd gefinancierd door de Noorse Health Association, de Noorse Onderzoeksraad en de apparatuur van de microscopie werd gefinancierd door Norbrain.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
