Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie
Summary
Myelinating Oligodendrozyten fördern schnelle Aktionspotential Ausbreitung und neuronale überleben. Hier beschriebene ist ein Protokoll für Oligodendrozyt-spezifischen Ausdruck der fluoreszierende Proteine in organotypischen Gehirnscheiben mit nachfolgenden Zeitraffer Bildgebung. Darüber hinaus wird ein einfaches Verfahren zur Visualisierung von ungefärbten Myelin vorgestellt.
Abstract
Nervenzellen setzen auf die elektrische Isolierung und trophischen Unterstützung der Myelinating Oligodendrozyten. Trotz der Bedeutung der Oligodendrozyten wurden die erweiterte Tools derzeit verwendet, um Neuronen, studieren nur teilweise getroffen auf Oligodendrozyt Forscher. Zelle typspezifische Färbung durch virale Transduktion ist ein sinnvoller Ansatz, live Organelle Dynamik zu studieren. Dieser Beitrag beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung von Oligodendrozyt Mitochondrien in organotypischen Gehirnscheiben durch Transduktion mit Adeno-assoziierte Virus (AAV) mit Genen für mitochondriale gezielte fluoreszierende Proteine von transkriptionelle kontrolliert Das Myelin basic Protein Förderer. Freuen Sie sich auf das Protokoll zur Herstellung von organotypischen koronalen Maus Gehirnscheiben. Ein Verfahren für Zeitraffer-Aufnahmen von Mitochondrien dann folgt. Diese Methoden auf andere Organellen übertragen werden können und möglicherweise besonders hilfreich für das Studium Organellen in der Myelinscheide. Schließlich beschreiben wir eine leicht verfügbare Technik zur Visualisierung von ungefärbten Myelin in lebenden Scheiben durch Reflexion der konfokalen Mikroskopie (CoRe). Kern erfordert keine zusätzliche Ausrüstung und kann nützlich sein, um die Myelinscheide während der live-Aufnahme zu identifizieren.
Introduction
Weißen Substanz des Gehirns besteht aus Nervenzellen Axone eingewickelt in Myelin, eine spezielle erweiterte Plasmamembran von Oligodendrozyten gebildet. Myelin ist für schnelle und zuverlässige Aktionspotential Ausbreitung und langfristiges Überleben der Markhaltige Axone erforderlich, und ein Verlust von Myelin kann neurologische Dysfunktion verursachen. Trotz ihrer großen Bedeutung sind die Eigenschaften von Oligodendrozyten weniger bekannte Neuronen und Astrozyten im Vergleich. Infolgedessen wurden weniger Werkzeuge für das Studium von Oligodendrozyten entwickelt.
Leben Sie Bildgebung von Zellorganellen, wie Mitochondrien, endoplasmatischen Retikulum (ER) oder verschiedene vesikuläre Strukturen, dynamische Veränderungen in der Organellen im Laufe der Zeit zu studieren nützlich sein können. Traditionell wurde Bildgebung der lebenden Oligodendrozyten in Monokulturen1,2durchgeführt. Jedoch Oligodendrozyten in Monokultur zeigen keine kompakte Myelin und organotypischen oder akuten Hirnschnitten, daher möglicherweise eine bessere Option bei der Lokalisierung und Bewegung der Organellen zu studieren. Lokalisierung von kleine Organellen und Proteinen in der Myelinscheide kann aufgrund der kurzen Entfernung zwischen Markhaltige Axon und die umgebenden Myelinscheide schwierig sein. So haben leichte mikroskopische Immunostaining Verfahren allein nicht die räumliche Auflösung zur Unterscheidung zwischen Organellen in der Myelinscheide und diejenigen in Markhaltige Axon. Dies kann durch virale Transduktion mit Genen für Organelle ausgerichtete fluoreszierende Proteine angetrieben von Zelle typspezifische Promotoren gelöst werden. Die Vorteile sind ein zellspezifische und spärlich Ausdruck, der genaue Beurteilung der Organelle Lokalisierung und Dynamik ermöglicht. Transgene Tiere können auch verwendet werden, um solch eine Organelle ausgerichtete zellspezifische Ausdruck3zu erreichen. Jedoch die Herstellung und Instandhaltung von transgenen Tieren ist teuer und bieten in der Regel nicht die spärlichen Ausdruck, der durch virale Methoden erreicht werden kann.
Die beschriebene Methode verwendet hier virale Transduktion von Oligodendrozyten mit mitochondrialen gezielt fluoreszierenden Proteinen (Dsred oder grün fluoreszierenden Proteins, GFP) angetrieben von Myelin basic Protein Promotor (MBP-Mito-Dsred oder MBP-Mito-GFP) zu visualisieren Oligodendrozyt Mitochondrien in organotypischen Hirnschnitten. Darüber hinaus wird Ausdruck einer anderen fluoreszierenden Proteins im Zytoplasma (GLP zusammen mit Mito-Dsred oder Tdtomato mit Mito-GFP verwendet) zur Visualisierung der Zellmorphologie, einschließlich der zytoplasmatischen Kompartimente der Myelinscheide ermöglichen. Das Protokoll enthält die Verfahren zur Herstellung von organotypischen Gehirnscheiben (eine modifizierte Version des Protokolls von De Simoni und Yu, 20064,5beschrieben). Dann beschreiben wir die Time-Lapse bildgebende Verfahren zur Untersuchung der mitochondrialen Bewegung. Dieses Verfahren nutzt eine aufrechte confocal Mikroskop mit einem kontinuierlichen Austausch von bildgebendes Medium, eine Einrichtung, die einfache Anwendung von Drogen oder anderen mittleren Änderungen während der Bildgebung ermöglicht. Die Time-Lapse bildgebende Verfahren kann auf jedem confocal Mikroskop mit einige zusätzliche Ausrüstung für die Aufrechterhaltung der lebenden Scheiben wie unten beschrieben durchgeführt werden. Das Protokoll enthält auch einige Tipps zur Optimierung der Bildgebung und Reduzierung Phototoxizität.
Zu guter Letzt bezeichnet man eine schnelle und einfache Möglichkeit, ungefärbten Myelin durch Reflexion der konfokalen Mikroskopie (CoRe) zu visualisieren. Dies ist nützlich, um die Myelinscheide während der live-Aufnahme zu identifizieren. In den letzten Jahren verschiedene Techniken wurden entwickelt um Bild Myelin ohne jede Färbung erforderlich, aber die meisten von Ihnen erfordern spezifische Ausstattung und Kompetenz6,7,8. Das hier beschriebene Verfahren verwendet die Reflexionseigenschaften der Myelinscheide und ist eine vereinfachte Single-Erregung Wellenlänge Version der spektrale Reflexion der konfokalen Mikroskopie (Partitur, in denen mehrere-Wellenlängen Laser werden kombiniert, um Myelin zu visualisieren) 9. Kern kann auf jede confocal Mikroskop, das 488 nm Laser und ein 470-500 nm Emission Bandpassfilter oder einen einstellbaren Emission Filter erfolgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll zur Herstellung von organotypischen Kulturen hier beschrieben ist eine modifizierte Version18 des Protokolls von De Simoni und Yu (2006)5beschrieben. Die wichtigsten Änderungen sind nachfolgend dargelegt worden. TRIS-Puffer ist das Kulturmedium hinzugefügt, die das Überleben der Scheiben wenn außerhalb des Inkubators während virale Transduktion und Wechsel des Mediums Zelle verbessert. Die Sterilisation für Konfetti wird ebenfalls geändert. Während and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Linda Hildegard Bergersen und Magnar Bjørås für den Zugang zu Handy-Lab und Ausrüstung, Janelia Molekularbiologie gemeinsame Ressource Personal für Plasmid und Virus-Produktion und Koen Vervaeke Unterstützung bei Lasermessungen macht. Diese Arbeit wurde von der norwegischen Health Association, der Norwegische Forschungsrat finanziert und die Mikroskopie-Ausrüstung wurde durch Norbrain finanziert.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
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