Visualisering og Live Imaging af Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjerne skiver ved hjælp af Adeno-associeret Virus og konfokal mikroskopi
Summary
Myelinating oligodendrocytes fremme hurtig aktionspotentialet formering og neuronal overlevelse. Beskrevet her er en protokol til oligodendrocyte-specifikke udtryk af fluorescerende proteiner i organotypic hjerne skiver med efterfølgende time-lapse billeddannelse. Derudover præsenteres en enkel procedure til at visualisere unstained myelin.
Abstract
Neuroner stole på elektrisk isolering og trofiske støtte af myelinating oligodendrocytes. Trods vigtigheden af oligodendrocytes, har de avancerede værktøjer i øjeblikket brugt til at studere neuroner, kun delvist taget af oligodendrocyte forskere. Celle type-specifikke farvning af viral transduktion er en nyttig tilgang til at studere levende organelle dynamics. Dette papir beskriver en protokol til at visualisere oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjerne skiver af transduktion med adeno-associeret virus (AAV) bærer gener for mitokondrie målrettede fluorescerende proteiner under transcriptional kontrol myelin grundlæggende protein promotor. Det omfatter protokollen for at gøre organotypic koronale mus hjernen skiver. En procedure for time-lapse billeddannelse af mitokondrier derefter følger. Disse metoder kan overføres til andre organeller og kan være særligt nyttigt for at studere organeller i myelinskeden. Endelig, vi beskriver en let tilgængelige teknik til visualisering af unstained myelin i levende skiver af Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (kerne). CoRe kræver ingen ekstra udstyr og kan være nyttigt at identificere myelinskeden under live imaging.
Introduction
Hjernens hvide substans består af nerve celle axoner indpakket i myelin, et specialiseret udvidet plasmamembran dannet af oligodendrocytes. Myelin er behov for hurtig og pålidelig aktionspotentialet formering og langsigtede overlevelse af myelinerede axoner, og et tab af myelin kan forårsage neurologiske dysfunktion. Trods deres betydning, er egenskaberne for oligodendrocytes mindre kendt sammenlignet med neuroner og astrocytter. Derfor er færre værktøjer blevet udviklet for at studere oligodendrocytes.
Live imaging af celle organeller som mitokondrier, endoplasmatic reticulum (ER) eller forskellige vesikulære strukturer kan være nyttigt at undersøge dynamiske ændringer i organeller over tid. Billeddannelse af levende oligodendrocytes er traditionelt udført i monokulturer1,2. Men oligodendrocytes i monokultur Vis ikke kompakt myelin, og organotypic eller akut hjernen skiver kan derfor være en bedre løsning når man studerer lokalisering og bevægelse af organeller. Lokalisering af små organeller og proteiner i myelinskeden kan være udfordrende på grund af den korte afstand mellem myelinerede axon og de omkringliggende myelinskeden. Lys mikroskopiske immunfarvning procedurer alene har således ikke den rumlige opløsning til at diskriminere mellem organeller i myelinskeden og myelinerede axon. Dette kan løses ved viral transduktion med gener for organelle-målrettet fluorescerende proteiner drevet af celle typespecifikke initiativtagere. Fordelene er en celle-specifikke og sparsom udtryk, som muliggør nøjagtig vurdering af organelle lokalisering og dynamik. Transgene dyr kan også bruges til at opnå sådanne en organelle-målrettet celle-specifikke udtryk3. Men produktion og vedligeholdelse af transgene dyr er dyre og tilbyder normalt ikke den sparsomme udtryk, der kan opnås ved viral metoder.
Metoden beskrevet bruger her viral transduktion af oligodendrocytes med mitokondrie-målrettet fluorescerende proteiner (dsred eller grøn fluorescerende proteiner, normal god landbrugspraksis) drevet af myelin grundlæggende protein promoter (MBP-mito-dsred eller MBP-mito-NGL) at visualisere oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjerne skiver. Derudover er udtryk for en anden fluorescerende proteiner i cytoplasma (normal god landbrugspraksis bruges sammen med mito-dsred eller tdtomato bruges med mito-normal god landbrugspraksis) bruges til at aktivere visualisering af celle morfologi, herunder de cytoplasmatisk rum af myelinskeden. Protokollen omfatter proceduren for organotypic hjernen skiver (en modificeret version af protokollen, beskrevet af De Simoni og Yu, 20064,5). Vi derefter beskrive proceduren for time-lapse imaging for at studere mitokondrie bevægelse. Denne procedure bruger en opretstående Konfokal mikroskop med en løbende udveksling af billeddiagnostiske medium, en opsætning, der giver mulighed for nem anvendelse af narkotika eller andre mellemstore ændringer under imaging. Time-lapse imaging proceduren kan udføres på en Konfokal mikroskop, med nogle ekstra udstyr til at opretholde levende skiver som beskrevet nedenfor. Protokollen indeholder også flere tips til at optimere imaging og reducere fototoksicitet.
Endelig, en hurtig og enkel måde at visualisere unstained myelin ved Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (kerne) er beskrevet. Dette kan være nyttigt at identificere myelinskeden under live imaging. I de seneste år, flere teknikker er blevet udviklet til billede myelin uden nogen farvning kræves, men de fleste af disse kræver specifikke udstyr og ekspertise6,7,8. Proceduren beskrevet her bruger de reflekterende egenskaber af myelinskeden og er en forenklet single-excitation bølgelængde version spektrale Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi (SCoRe, hvor flere laser bølgelængder er kombineret til at visualisere myelin) 9. coRe kan ske på enhver Konfokal mikroskop, der har en 488 nm laser og en 470-500 nm bandpass emission filter eller en afstemmelige emission filter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol for at gøre organotypic kulturer beskrevet her er en modificeret udgave18 i protokollen beskrevet af De Simoni og Yu (2006)5. De vigtigste ændringer er blevet skitseret nedenfor. Tris buffer er føjet til næringssubstrat, som forbedrer overlevelsen af skiver når uden for inkubator under viral transduktion og ændring af celle-medium. Sterilisering procedure for konfetti er også ændret. Mens andre protokoller sterilisere konfetti ved autoklavering, vi ikke anb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Linda Hildegard Bergersen og Magnar Bjørås for adgang til celle lab og udstyr, Janelia Molekylærbiologi delt ressource personale for plasmid og virus produktion og Koen Vervaeke for bistand med laser power målinger. Dette arbejde blev finansieret af den norske Health Association, det norske Forskningsråd og mikroskopi udstyr blev finansieret af Norbrain.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
