Myelinating oligodendrocytes तेजी से कार्रवाई संभावित प्रसार और ंयूरॉन अस्तित्व को बढ़ावा देने के । यहां वर्णित oligodendrocyte के लिए एक प्रोटोकॉल है organotypic मस्तिष्क स्लाइस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बाद के समय के साथ विशिष्ट अभिव्यक्ति इमेजिंग । इसके अलावा, दाग myelin visualizing के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रस्तुत की है ।
न्यूरॉन्स बिजली के इंसुलेशन और myelinating oligodendrocytes के पौष्टिकता समर्थन पर भरोसा करते हैं । oligodendrocytes के महत्व के बावजूद, उंनत उपकरण वर्तमान में न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया, केवल आंशिक रूप से oligodendrocyte शोधकर्ताओं द्वारा पर लिया गया है । सेल प्रकार-वायरल transduction द्वारा दाग विशिष्ट लाइव organelle गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । यह पत्र adeno के साथ transduction द्वारा organotypic मस्तिष्क स्लाइस में oligodendrocyte mitochondria visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-जुड़े वायरस (AAV) mitochondrial नियंत्रण के तहत transcriptional लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जीन ले myelin बुनियादी प्रोटीन प्रमोटर । यह organotypic कोरोनरी माउस मस्तिष्क स्लाइसें बनाने के लिए प्रोटोकॉल शामिल हैं । mitochondria की समय-चूक इमेजिंग के लिए एक प्रक्रिया तो इस प्रकार है । इन पद्धतियों को अन्य organelles को हस्तांतरित किया जा सकता है और myelin म्यान में अध्ययनरत organelles के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है. अंत में, हम फोकल चिंतनशील माइक्रोस्कोपी (कोर) द्वारा स्लाइसें में रहने वाले दाग myelin के दृश्य के लिए एक आसानी से उपलब्ध तकनीक का वर्णन । कोर कोई अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता है और लाइव इमेजिंग के दौरान myelin म्यान की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
मस्तिष्क की सफेद बात तंत्रिका कोशिका axons से बना है myelin, एक विशेष विस्तारित प्लाज्मा oligodendrocytes द्वारा गठित झिल्ली में लिपटे । Myelin तेज और विश्वसनीय कार्रवाई संभावित प्रसार और myelinated axons के दीर्घकालिक अस्तित्व के लिए आवश्यक है, और Myelin का नुकसान स्नायविक रोग पैदा कर सकता है । उनके महत्व के बावजूद, oligodendrocytes के गुणों न्यूरॉन्स और astrocytes के साथ तुलना में कम जाना जाता है. नतीजतन oligodendrocytes के अध्ययन के लिए कम औजार विकसित किए गए हैं ।
सेल organelles की लाइव इमेजिंग जैसे mitochondria, endoplasmatic जालिका (ER) या अलग vesicular संरचनाओं समय के साथ organelles में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है । परंपरागत रूप से, रहने वाले oligodendrocytes की इमेजिंग monocultures1,2में प्रदर्शन किया गया है । हालांकि, monoculture में oligodendrocytes कॉम्पैक्ट myelin प्रदर्शित नहीं करते हैं, और organotypic या तीव्र मस्तिष्क स्लाइस कर सकते हैं, इसलिए, एक बेहतर विकल्प हो सकता है जब स्थानीयकरण और organelles के आंदोलन का अध्ययन. myelin म्यान में छोटे organelles और प्रोटीन का स्थानीयकरण myelinated axon और आसपास के myelin म्यान के बीच कम दूरी के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस प्रकार, प्रकाश सूक्ष्म immunostaining प्रक्रियाओं अकेले myelin म्यान में organelles और myelinated axon में उन लोगों के बीच भेदभाव करने के लिए स्थानिक संकल्प नहीं है । यह organelle के लिए जीन के साथ वायरल transduction द्वारा हल किया जा सकता है लक्षित फ्लोरोसेंट सेल प्रकार विशेष प्रमोटरों द्वारा संचालित प्रोटीन । लाभ एक कोशिका-विशिष्ट और विरल अभिव्यक्ति है, जो organelle स्थानीयकरण और गतिशीलता का सटीक आकलन सक्षम करता है । ट्रांसजेनिक पशुओं को भी ऐसे organelle-लक्षित कक्ष-विशिष्ट व्यंजक3को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । हालांकि, ट्रांसजेनिक पशुओं के उत्पादन और रखरखाव महंगा है और आम तौर पर विरल अभिव्यक्ति है कि वायरल तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है प्रदान नहीं करता है ।
यहां वर्णित विधि mitochondrial-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (dsred या ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP) myelin बुनियादी प्रोटीन प्रमोटर (MBP-मिळो-dsred या MBP-मिळो-GFP) द्वारा संचालित के साथ oligodendrocytes के वायरल transduction का उपयोग करता है कल्पना organotypic ब्रेन स्लाइसेस में oligodendrocyte mitochondria । इसके अलावा, कोशिका में एक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति (या तो GFP के साथ एक साथ इस्तेमाल किया-dsred या tdtomato-GFP के साथ प्रयोग किया जाता है) कक्ष आकृति विज्ञान, cytoplasmic म्यान के myelin डिब्बों सहित दृश्य सक्षम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रोटोकॉल organotypic मस्तिष्क स्लाइसें (डी सिमौनी और यू, २००६4,5) द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण बनाने के लिए प्रक्रिया भी शामिल है । हम तो mitochondrial आंदोलन का अध्ययन करने के लिए समय चूक इमेजिंग प्रक्रिया का वर्णन । यह प्रक्रिया इमेजिंग के दौरान एक सतत विनिमय के साथ एक ईमानदार फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है, एक सेटअप है कि इमेजिंग के दौरान दवाओं या अंय मध्यम परिवर्तन के आसान आवेदन सक्षम बनाता है । समय चूक इमेजिंग प्रक्रिया किसी भी फोकल माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है, नीचे वर्णित के रूप में रहने वाले स्लाइस बनाए रखने के लिए कुछ अतिरिक्त उपकरणों के साथ । प्रोटोकॉल भी इमेजिंग का अनुकूलन और phototoxicity कम करने के लिए कई सुझाव शामिल हैं ।
अंत में, एक त्वरित और सरल करने के लिए फोकल रिफ्लेक्टर माइक्रोस्कोप (कोर) द्वारा दाग myelin कल्पना तरीका वर्णित है । यह लाइव इमेजिंग के दौरान myelin म्यान की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है । हाल के वर्षों में, कई तकनीकों किसी भी आवश्यक दाग के बिना छवि myelin को विकसित किया गया है, लेकिन इनमें से ज्यादातर विशिष्ट उपकरणों और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है6,7,8। प्रक्रिया यहां वर्णित myelin म्यान के चिंतनशील गुणों का उपयोग करता है और एक सरल एकल उत्तेजना वर्णक्रमीय फोकल चिंतनशील माइक्रोस्कोपी की तरंग दैर्ध्य संस्करण (स्कोर, जिसमें कई लेजर तरंग दैर्ध्य myelin कल्पना करने के लिए संयुक्त कर रहे हैं) 9. कोर किसी भी फोकल माइक्रोस्कोप है कि एक ४८८ एनएम लेजर और एक ४७०-५०० एनएम bandpass उत्सर्जन फ़िल्टर या एक स्वरित्र उत्सर्जन फिल्टर है पर किया जा सकता है ।
यहां बताई गई प्रक्रियाओं को नार्वे के पशु अनुसंधान प्राधिकरण ने अनुमोदित कर दिया है । माल और अन्य आवश्यक उपकरणों के लिए आपूर्तिकर्ताओं और कैटलॉग संख्या दस्तावेज़ के अंत में सामग्री सूची में उपलब्ध …
organotypic संस्कृतियों बनाने के लिए प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक संशोधित संस्करण डी सिमौनी और यू द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के18 है (२००६)5। सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तन नीचे उल्लिखित किया गया है । Tris ?…
The authors have nothing to disclose.
हम लिंडा Hildegard Bergersen और सेल लैब और उपकरण, Janelia आणविक जीवविज्ञान प्लाज्मिड और वायरस के उत्पादन और कोएन वर्वेके लेजर शक्ति माप के साथ सहायता के लिए के लिए संसाधन कर्मचारी साझा करने के लिए उपयोग के लिए Bjørås मागणार धंयवाद । यह काम नार्वे स्वास्थ्य संघ, नार्वे अनुसंधान परिषद और सूक्ष्म उपकरण द्वारा वित्त पोषित किया गया Norbrain द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Agarose | Sigma | A9539 | |
BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
Bioxide gas | AGA | 105701 | |
Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
CaCl2 | Fluka | 21100 | |
CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
Parafilm | VWR | 291-1211 | |
Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
Trizma base | Sigma | T1503 | |
Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |