Visualisering och levande avbildning av Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjärnan skivor med hjälp av Adeno-associerade Virus och konfokalmikroskopi
Summary
Myelinating oligodendrocyter främja snabb aktionspotentialens spridning och neuronal överlevnad. Beskrivs här är ett protokoll för oligodendrocyte-specifika uttryck av fluorescerande proteiner i organotypic hjärnan skivor med efterföljande time-lapse imaging. Vidare presenteras en enkel procedur för att visualisera ofärgade myelin.
Abstract
Nervceller är beroende av att elektrisk isolering och trofiska stödja myelinating oligodendrocyter. Trots betydelsen av oligodendrocyter, har de avancerade verktygen som för närvarande används för att studera nervceller, endast delvis tagits av oligodendrocyte forskare. Cell typspecifika färgning av viral transduktion är en användbar metod för att studera levande organell dynamics. Detta dokument beskriver ett protokoll för att visualisera oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjärnan skivor genom transduktion med adeno-associerade virus (AAV) bär gener för mitokondriell riktade fluorescerande proteiner under transkriptionell kontroll myelin grundläggande protein arrangören. Det inkluderar protokollet för att göra organotypic koronalt mus hjärnan skivor. Ett förfarande för time-lapse avbildning av mitokondrier sedan följer. Dessa metoder kan överföras till andra organeller och kan vara särskilt användbart för att studera organeller i myelinskidan. Slutligen beskriver vi en lättillgänglig teknik för visualisering av ofärgade myelin i levande skivor av Confocal reflektans mikroskopi (CoRe). Kärnan kräver ingen extra utrustning och kan vara användbart för att identifiera myelinskidan under levande imaging.
Introduction
Hjärnans vita substansen består av nervcell axoner insvept i myelin, en specialiserad utökade plasmamembranet som bildas av oligodendrocyter. Myelin krävs för snabb och tillförlitlig aktionspotentialens spridning och långsiktiga överlevnad av myeliniserade axoner, och en förlust av myelin kan orsaka neurologisk dysfunktion. Trots sin vikt jämförs egenskaper för oligodendrocyter mindre kända med nervceller och astrocyter. Följaktligen har färre verktyg utvecklats för att studera oligodendrocyter.
Live avbildning av cell organeller som mitokondrier, endoplasmatic Retikulum (ER) eller olika vesikulär strukturer kan vara användbart för att studera dynamiska förändringar i organeller över tid. Avbildning av levande oligodendrocyter har traditionellt utförts i monokulturer1,2. Men oligodendrocyter i monokultur visar inte kompakt myelin och organotypic eller akut hjärnskada skivor kan därför vara ett bättre alternativ när man studerar lokalisering och förflyttning av organeller. Lokalisering av små organeller och proteiner i myelinskidan kan vara utmanande på grund av det korta avståndet mellan myeliniserade axon och den omgivande myelinskidan. Ljus mikroskopiska immunfärgning förfaranden ensam har således inte den rumsliga upplösningen att diskriminera mellan organeller i myelinskidan och i myeliniserade axon. Detta kan lösas genom viral transduktion med gener för organell-riktade fluorescerande proteiner drivs av cell typspecifika initiativtagare. Fördelarna är en cell-specifika och glesa uttryck, som möjliggör exakt bedömning av organell lokalisering och dynamik. Transgena djur kan också användas för att uppnå sådan en organell-riktade-specifika uttryck3. Produktion och underhåll av transgena djur är dock dyra och oftast erbjuder inte det glesa uttryck som kan uppnås genom viral metoder.
Den metod som beskrivs använder här viral transduktion av oligodendrocyter med mitokondrie-riktade fluorescerande proteiner (dsred eller grön fluorescerande proteinet, GFP) drivs av promotorn myelin grundläggande protein (MBP-mito-dsred eller MBP-mito-GFP) för att visualisera oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjärnan skivor. Dessutom används uttrycket av en annan fluorescerande protein i cytoplasman (GFP används tillsammans med mito-dsred eller tdtomato används med mito-GFP) för att aktivera visualisering av cellmorfologi, inklusive de cytoplasmiska fack i myelinskidan. Protokollet omfattar förfarandet för att göra organotypic hjärnan skivor (en modifierad version av protokollet beskrivs av De Simoni och Yu, 20064,5). Sedan beskriver vi time-lapse imaging proceduren för att studera mitokondriell rörelse. Proceduren använder en upprätt confocal Mikroskop med ett kontinuerligt utbyte av imaging medium, en setup som möjliggör enkel applicering av droger eller andra medelstora förändringar under imaging. Time-lapse imaging förfarandet kan utföras på någon confocal Mikroskop, med några extra utrustning för att upprätthålla levande skivor som beskrivs nedan. Protokollet innehåller också flera tips för att optimera imaging och minska fototoxicitet.
Slutligen beskrivs ett snabb och enkelt sätt att visualisera ofärgade myelin av Confocal reflektans mikroskopi (CoRe). Detta kan vara användbart för att identifiera myelinskidan under levande imaging. Under senare år har flera tekniker utvecklats till bild myelin utan någon färgning krävs, men de flesta av dessa kräver särskild utrustning och expertis6,7,8. Proceduren som beskrivs här använder myelinskidan reflekterande egenskaper och är en förenklad singel-magnetiseringen våglängd version av spektral reflektans Confocal microscopy (poäng, där laser flera våglängder kombineras för att visualisera myelin) 9. kärna kan göras på någon confocal Mikroskop som har en 488 nm laser och en 470-500 nm bandpassfilter utsläpp eller ett avstämbara utsläpp filter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet för att göra organotypic kulturer beskrivs här är en modifierad version18 i protokollet beskrivs av De Simoni och Yu (2006)5. De viktigaste förändringarna har varit som beskrivs nedan. Tris buffert läggs till odlingsmediet, vilket förbättrar överlevnaden av skivor när utanför inkubatorn under viral transduktion och ändra cellen mediets. Sterilisering förfarandet för konfetti ändras också. Medan andra protokoll sterilisera konfetti i autoklav, re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Linda Hildegard Bergersen och Magnar Bjørås för åtkomst till cell lab och utrustning, Janelia molekylärbiologi delade resurs personal för plasmid och virus produktion och Koen Vervaeke för hjälp med laser power mätningar. Detta arbete finansierades av den norska Health Association, det norska forskningsrådet och mikroskopi utrustningen finansierades av Norbrain.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
