Préparation des échantillons pour l’analyse de Endopeptidomic dans le liquide céphalorachidien humaine
Summary
On présente une méthode d’analyse par spectrométrie de masse de peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. En utilisant la filtration de limite de poids moléculaire, fractionnement chromatographique de pré, analyse par spectrométrie de masse et une combinaison subséquente des stratégies d’identification de peptide, il était possible d’étendre la peptidome CSF connu presque décuplé par rapport à des études antérieures.
Abstract
Ce protocole décrit une méthode mise au point pour identifier les peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. Pour ce faire, une méthode déjà élaborée basée sur la filtration de coupure (MWCO) de poids moléculaire et analyse par spectrométrie de masse a été combinée avec une étape de pré fractionnement HPLC hors ligne pH élevé en phase inverse.
Sécrétion dans le CSF est la principale voie d’élimination des molécules répandu par les cellules du système nerveux central. Ainsi, de nombreux processus dans le système nerveux central sont consignées dans le LCR, en rendant un précieux fluide diagnostique. CSF a une composition complexe, contenant des protéines qui couvrent une gamme de concentrations de 8-9 ordres de grandeur. En plus des protéines, des études antérieures ont également démontré la présence d’un grand nombre de peptides endogènes. Tandis que les moins étudiés que les protéines, elles conserveront également susceptibles d’intéresser comme biomarqueurs.
Les peptides endogènes ont été séparés de la teneur en protéines par le biais de filtration MWCO CSF. En supprimant la majorité de la teneur en protéines de l’échantillon, il est possible d’augmenter le volume de l’échantillon étudié et ainsi le montant total des peptides endogènes. La complexité du mélange peptide filtrée a été adressée en incluant une phase inverse étape avant fractionnement (CLHP) à pH alcalin avant l’analyse de LC-MS. Le fractionnement a été combiné avec un schéma simple concaténation où 60 fractions ont été regroupées en 12, consommation de temps d’analyse pourrait ainsi être réduite en évitant encore largement élution Co.
Peptide automatisé identification a été réalisée à l’aide de trois programmes de logiciel d’identification différents peptides/protéines et ensuite combiner les résultats. Les différents programmes sont complémentaires et non comparable avec moins de 15 % des identifications avec chevauchement entre les trois.
Introduction
Biomarqueurs dans le liquide céphalorachidien (LCR) transforment actuellement recherche dans les maladies neurodégénératives. Dans la maladie d’Alzheimer, la maladie neurodégénérative plus commune, affectant plus 60 millions de personnes dans le monde1,2, un triplet de biomarqueurs de la bêta-amyloïde de peptide, stabilisation des microtubules protéine tau et un phosphorylée forme tau, capable de détecter la maladie avec une spécificité et une sensibilité élevée et a été inclus dans les critères de recherche diagnostique3. Dans d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson et la sclérose en plaques, des études protéomiques ont identifié de nombreux candidats de biomarqueurs, dont certains sont actuellement en cours d’évaluation dans les études cliniques4,5 ,6.
Aux côtés de protéines, CSF contient également une abondance de peptides endogènes7,8,9,10,11,12. Constituant des produits de clivage de nombreuses protéines encéphales, ces peptides représentent également une source potentiellement importante de biomarqueurs de la maladie. Pour augmenter l’inventaire des peptides endogènes identifiés dans le LCR humaine et que les analyses endopeptidomic CSF dans les études cliniques, il a développé une méthode pour la préparation des échantillons et l’analyse de LC-MS (un schéma de protocole bref a été inclus dans la Figure 1 ). L’application de cette méthode dans une étude récente a permis l’identification de presque 16 400 peptides endogènes de CSF dans les échantillons de LCR mise en commun de plusieurs individus de diagnostic non spécifique, élargissant l’endopeptidome CSF connu dix fois13. La méthode peut éventuellement être utilisée parallèlement aux isobare approche étiquetage pour la quantification.
Préparation des échantillons
La principale source de masse des protéines dans le LCR est constituants du plasma (par ex. albumine et des immunoglobulines) passant sur le sang cerveau barrière14,15. Leur abondance gêne la détection des composants de l’échantillon faible-abondant, dérivé du cerveau. Les peptides endogènes peuvent être aisément séparées des protéines haute-abondantes, permettant ainsi un volume beaucoup plus important d’extrait peptide CSF à utiliser pour l’analyse de LC-MS, permettant la détection des peptides moins abondantes.
Dans le protocole présenté ici, filtration de coupure (MWCO) de poids moléculaire a été utilisée pour séparer les peptides de CSF de la fraction protéique ; une méthode qui a été utilisée dans plusieurs précédentes études8,9,10,11,12,16. L’étape de filtration a été suivie d’une étape de fractionnement avant RP HPLC hors connexion effectuée sur un gradient de phase mobile pH élevé. En effectuant deux étapes de RP HPLC en tandem, avec pH étant la principale distinction, la différence de sélectivité entre les deux étapes provient essentiellement de rétention des peptides modifiés par suite de peptides différents États de charge. La demande de fractionnement pre peptide pH élevé avant SM-dans des conditions acides s’est avérée efficace en augmentant la peptide identification17,18et même à être supérieure à cette fin dans le complexe biologique échantillons par rapport aux plus séparation orthogonale modes19, tels que chat-ions forts exchange (SCX) et PR20. Pour raccourcir le temps d’analyse, un plan de concaténation a été utilisé, mise en commun de chaque fractionth 12 (p. ex., fractions 1, 13, 25, 37 et 49), qui, en raison de la puissance de haute résolution de RP HPLC, encore largement évité co élution de peptides à partir de différents fractions dans la SM-étape20,21.
Identification de peptide
Identification de peptide dans les études de peptidomic diffère de celle des études protéomiques car aucun clivage enzymatique ne peut être spécifié dans la recherche de la base de données, et en conséquence, le taux d’identification sont habituellement inférieur à11. Une récente étude13 ont montré que les tarifs d’identification pour les peptides endogènes obtenus avec Sequest et mascotte ont été sensiblement améliorées lorsque la valeur par défaut marquant l’algorithme du logiciel respectif a été modifiée à l’aide de la notation adaptative algorithme de percolateur, indiquant que les algorithmes de notation optimales pour les peptides endogènes diffèrent de celle des peptides tryptiques13. À cet étude, identification basée sur le séquençage de novo de peptide automatique en utilisant le logiciel pics (BSI) s’est avéré pour être complémentaires aux moteurs de recherche axée sur les empreintes digitales deux fragment ions, résultant en un ensemble beaucoup plus important d’identifiés peptides.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’introduction d’un pH élevé RP HPLC avant fractionnement pas un protocole développé antérieurement pour la récupération de peptides endogènes de poids moléculaire ultrafiltration11 échantillon relative complexité réduite et ainsi autorisé pour un 5 fois plus grand volume de l’échantillon à étudier. Ceci, à son tour, augmente la concentration du sous-ensemble des peptides présents dans chacune des fractions et ainsi amélioré les chances de détecter les faibles peptides a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un grand Merci Tanveer Batth et ses collègues pour obtenir des conseils à mettre en place la méthode de fractionnement préalable.
Ce travail a été financé par le Conseil de recherche suédois, le Wallström et Sjöblom Foundation, le pistolet et Bertil Stohne Fondation Stiftelse, la Fondation de Bergwall Magnus, la Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut et Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen et FoU-Västra Götalandsregionen.
Les principaux bénéficiaires du financement de ce projet ont été Kaj Blennow, Henrik Zetterberg et Johan Gobom.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
