인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

Summary

인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드의 질량 spectrometric 분석 하는 방법을 제시 합니다. 채용 함으로써 분자량 컷오프 필터링, 크로마 사전 분류, 대량 spectrometric 분석 및 펩 티 드 식별 전략의 후속 조합, 그것은 거의 10 배 비해 알려진된 CSF peptidome 확장 가능 이전 연구입니다.

Abstract

이 프로토콜 인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드를 식별 하기 위해 개발 하는 방법을 설명 합니다. 이 위해 이전 개발된 방법 분자량 컷오프 (MWCO) 여과에 기반 하 고 대량 spectrometric 분석 오프 라인 높은 pH 역 상 HPLC 사전 분류 단계와 결합 되었다.

CSF로 분 비 중추 세포에 의해 창 고 분자의 제거를 위한 주요 통로 이다. 따라서, 중앙 신경 시스템에 많은 프로세스 CSF, 그것에 게 귀중 한 진단 유체 렌더링에 반영 됩니다. CSF는 8-9 배나의 농도 범위에 걸쳐 있는 단백질을 포함 하는 복잡 한 구성, 있다. 단백질, 게다가 이전 연구 또한 내 인 성 펩 티 드의 많은 수의 존재를 증명 하고있다. 단백질 보다 덜 광범위 하 게 공부 하는 동안이 또한 생체로 잠재적인 관심을 고정할 수 있습니다.

내 인 성 펩 티 드 MWCO 여과 통해 CSF 단백질 함량에서 분리 되었다. 샘플에서 대부분의 단백질 콘텐츠를 제거 하 여 공부 샘플 볼륨 및 그로 인하여 또한 내 인 성 펩 티 드의 총 금액 증가 가능 하다. 침투 펩 티 드 혼합물의 복잡성 역 위상 LC MS 분석 전에 알칼리 pH에서 (RP) HPLC 사전 분류 단계를 포함 하 여 해결 했다. 분류는 결합 되었다 60 분수 12에 풀링된 했다 간단한 연결 계획, 분석 시간 소비 함으로써 감소 될 수 있었다 아직도 크게 공동 차입을 피하고 있는 동안.

자동화 된 펩 티 드 식별 3 가지 펩타이드/단백질 식별 소프트웨어 프로그램을 사용 하 고 이후 결과 결합 하 여 수행 되었다. 다른 프로그램 보완 보다는 세 사이 겹쳐 식별의 15%와 비교 했다.

Introduction

뇌 척추 액체 (CSF)에서 생체 신경 퇴행 성 질환으로 현재 연구를 변형 시키고 있다. 전세계^1,2, 펩 티 드 아 밀 로이드 베타 단백질 타우 microtubule 안정화의 구성 된 바이오 마커 triplet 사람들은 Alzheimer의 질병, 60 백만 이상에 영향을 미치는 가장 일반적인 신경 장애, 그리고 phosphorylated 타우 형태, 높은 감도와 특이성, 질병을 검색할 수 있습니다 및 진단 연구 조건³에 포함 되었습니다. 다른 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병, 다 발성 경화 증 등에서 proteomic 연구의 일부는 현재 임상 연구^{4,5 에서에서 평가 받고 있다 수많은 바이오 마커 후보 식별 6}.

CSF에는 단백질, 함께 내 인 성 펩 티 드^{7,8,9,10,,1112}의 풍부한을 또한 포함 되어 있습니다. 많은 두뇌 파생 된 단백질의 분열 제품 구성, 이러한 펩 티이 드 또한 질병 biomarkers의 잠재적으로 중요 한 소스를 나타냅니다. 인간 CSF에서 확인 된 내 인 성 펩 티 드의 재고 증가 및 CSF endopeptidomic 분석 임상 연구에 사용, 방법 개발 샘플 준비 및 LC MS 분석 (간단한 프로토콜 스키마에에서 포함 된 그림 1 ). 최근 연구에서이 방법의 응용 확대 알려진된 CSF endopeptidome ten-fold¹³일반적인 진단의 몇몇 개인에서 풀링된 CSF 샘플에 거의 16,400 생 CSF 펩 티 드의 식별에 결과. 메서드를 선택적으로 정량화를 위한 isobaric 라벨 방식으로 함께에서 사용할 수 있습니다.

샘플 준비

CSF 단백질 질량의 주요 소스는 플라즈마 성분 (알 부 민 및 면역 글로불린) 혈액 두뇌 방 벽^14,15위에 통과. 그들의 높은 풍부 낮은 풍부 하 고, 두뇌 파생 샘플 구성 요소 검색에 지장을 초래할 수 있습니다. 내 인 성 펩 티 드를 쉽게 따라서 낮은 풍부한 펩 티 드의 탐지 하도록 LC MS 분석에 사용할 CSF 펩타이드 추출의 훨씬 더 큰 볼륨을 수 있도록 높은 풍부한 단백질에서 분리 수 있습니다.

여기에 제시 된 프로토콜에서 분자량 (MWCO) 잘라 여과 단백질 분수;에서 CSF 펩 티 드를 분리 사용 되었다 몇몇 이전에 사용 된 방법^{8,,910,11,,1216}공부 한다. 여과 단계는 높은 pH 모바일 위상 그라데이션을 통해 오프 라인 RP HPLC 사전 분류 단계에 선행 되었다. 주요 구별 되 고 ph에 두 RP HPLC 단계를 수행 하 여 두 단계 사이의 선택의 차이 다른 펩 티 드 충전 상태 결과로 변경 된 펩 티 드 보존에서 주로 발생 합니다. 산 성 조건 하에서 LC-MS 전에 높은 pH 펩 티 드 사전 분류의 응용 프로그램 펩 티 드 식별^17,18, 증가에 되도록 우수한이 목적을 위해 복잡 한 생물 학적 효과 입증 샘플 더 직각 분리 모드¹⁹, 강한 고양이-이온 교환 (SCX)와 RP²⁰에 비해. 분석 시간 단축, 연결 체계를 사용 되었다, 모든 12^번째 분수 (예를 들어, 분수 1, 13, 25, 37, 및 49), RP HPLC의 높은 분해능으로 인해 여전히 크게 다른 펩 티 드의 공동 차입을 피할 수 있는 풀링 LC-MS에서 분수^20,21단계.

펩 티 드 식별

Peptidomic 연구에서 펩 티 드 식별이 다릅니다 proteomic 연구의 아무 효소 분열 데이터베이스 검색에 지정할 수 있으며 식별 요금은 일반적으로 낮은¹¹는 결과적으로. 최근 연구¹³ 했다 내 인 성 펩 티 드로 얻은 Sequest 및 마스코트에 대 한 식별 요금 각각 소프트웨어 프로그램의 알고리즘을 득점 하는 기본 적응 점수를 사용 하 여 수정 된 때에 상당히 개선 했다 여과기, 내 인 성 펩 티 드에 대 한 최적의 점수 알고리즘 tryptic 펩 티 드¹³의 다 나타내는 알고리즘입니다. 연구, 식별 소프트웨어 봉우리 (BSI)를 사용 하 여 자동 펩타이드 de novo 연속에 따라 두 조각 이온 지문 기반 검색 엔진에 무료 발견 했다, 그의 훨씬 더 큰 집합에서 결과 확인 펩 티 드입니다.

Protocol

아래에 설명 된 프로토콜은 많은 양의 내 인 성 펩 티 드 인간 CSF15에 발견 했다 이전 연구에서 사용 되는 것의 세련 된 버전입니다. 원래 프로토콜에 대 한 업데이트 CSF의 화학 사전 처리에 사소한 변경 뿐만 아니라 오프 라인 높은 pH RP HPLC 사전 분류에 사용 되는 그라데이션의의 최적화를 포함 한다. 윤리적인 고려 사항 스웨…

Representative Results

여기 설명 하는 방법은 적용 되어 있으며 샘플 사전 분류 (표 1)을 도입 하기 전에 세 가지 연구에서 평가. 첫 번째 연구는 MALDI 표적 격판덮개에 CSF 분수를 안보에 대 한 오프 라인 LC를 사용 하 고 730 확인 된 내 인 성 펩 티 드11결과. 두 다음 연구에서 isobaric 라벨 고용 되었다. 케이스/제어에 주로 식별 및 CSF endopeptidome에 프로테옴 잠재적인 생체의 특성에 대 한 동시에 연구<sup class…

Discussion

높은 pH RP HPLC 사전 분류 하는 단계 내 인 성 펩 티 드의 복구에 대 한 이전 개발된 프로토콜 분자량 외¹¹ 의 상대 샘플 복잡성을 감소 및 그로 인하여 5-fold 더 큰 허용 공부를 해야 샘플 볼륨. 이, 차례로, 각 분수에 펩 티 드의 부분 집합의 농도 증가 하 고 그로 인하여 낮은 풍부한 펩 티 드는 검출의 기회를 향상.

동시에 3 개의 proteomic 소프트웨어 고용 내 인 성…

Materials

1 M Triethylammonium bicarbonate	Fluka, Sigma-Aldrich	17902-100ML	TEAB
8 M Guanidinium hydrochloride	Sigma-Aldrich	G7294-100ML	GdnHCl
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Pierce	20490	TCEP
Iodoacetamide	SIGMA	I1149-5G	IAA
Hydroxylamine 50% (w/w)	Sigma-Aldrich	457804-50ML
Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade	Sigma-Aldrich	271004-2L	AcN
Formic acid	Fluka, Sigma-Aldrich	56302-1mL-F	FA
Triflouroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	TFA
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	30501-1L-1M	NH4OH
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane	Merck Millipore	UFC903024	MWCO-filter
Sep-Pak C18, 100 mg	Waters	WAT023590	SPE-column
Resprep 12-port SPE Manifold	Restek	26077	Vacuum manifold
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set	Thermo Fisher Scientific	90110	TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC System	Dionex	5200.0356	Online sample separation
Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System	Dionex	IQLAAAGABHFAPBMBEZ	Offline high-pH fractionation
Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX	Mass spectrometer for sample analysis
Proteome Discoverer 2.0	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH	Proteomics search platform
Mascot v2.4	Matrix Science	-	Proteomics search engine
Sequest HT	Thermo	-	Proteomics search engine
PEAKS v7.5	Bioinformatic Solutions Inc.)	-	Proteomics search engine
Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size	Thermo Fisher Scientific	164535	Trap column (nano HPLC)
Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size	Thermo Fisher Scientific	164942	Separation Column (nano HPLC)
Savant SpeedVac High Capacity Concentrators	Thermo Fisher Scientific	SC210A-230	SpeedVac/Vacuum concentrator
XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm	Waters	186003566	Separation Column (micro HPLC)