Preparação da amostra para análise de Endopeptidomic no líquido cefalorraquidiano humano
Summary
É apresentado um método para análise de espectrometria de massa de peptídeos endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Empregando filtração de corte de peso molecular, pre- fracionamento cromatográfico de, análise de espectrometria de massa e uma subsequente combinação de estratégias de identificação do peptide, foi possível expandir o conhecido peptidome CSF quase dez vezes em comparação a estudos anteriores.
Abstract
Este protocolo descreve um método desenvolvido para identificar endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Para este propósito, um método previamente desenvolvido baseado na filtração de corte (MWCO) de peso molecular e análise de espectrometria de massa foi combinada com uma etapa de pre-fracionamento off-line alta-pH de fase reversa HPLC.
Secreção em CSF é a principal via para a remoção de moléculas derramado pelas células do sistema nervoso central. Assim, muitos processos no sistema nervoso central são refletidos no CSF, tornando-o um fluido de diagnóstico valioso. CSF tem uma composição complexa, contendo proteínas que abrangem uma gama de concentração de 8-9 ordens de magnitude. Além de proteínas, estudos anteriores também têm demonstrado a presença de um grande número de peptídeos endógenos. Enquanto menos extensivamente estudados do que proteínas, estas podem também realizar potencial interesse como biomarcadores.
Peptídeos endógenos foram separados do conteúdo de proteína do CSF através da filtragem MWCO. Removendo a maioria do teor de proteína da amostra, é possível aumentar o volume da amostra estudada e assim também o montante total dos peptides endógenos. A complexidade da mistura do peptide filtrado foi abordada, incluindo uma fase reversa etapa de pre-fracionamento HPLC (RP) em pH alcalino, antes da análise por LC-MS. O fracionamento foi combinado com um esquema simples concatenação onde 60 fracções foram agrupadas em 12, consumo de tempo de análise, assim, poderia ser reduzido, ainda em grande parte, evitando eluição co.
Identificação de peptídeo automatizado foi realizada usando três programas de software de identificação de peptídeos/proteínas diferentes e, posteriormente, combinando os resultados. Os diferentes programas foram complementares, ao invés de comparável com menos de 15% das identificações sobrepostas entre os três.
Introduction
Biomarcadores no líquido cerebrospinal (CSF) atualmente são transformar pesquisa em doenças neurodegenerativas. Na doença de Alzheimer, a doença neurodegenerativa mais comum, afetando mais 60 milhões pessoas em todo o mundo1,2, um trio de biomarcador consistindo o beta amyloid do peptide, estabilizadores do microtubule tau de proteína e um fosforilada forma de tau, pode detectar a doença com alta sensibilidade e especificidade e foi incluída na investigação diagnóstica critérios3. Em outras doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e esclerose múltipla, proteomic estudos identificaram numerosos candidatos biomarcador, alguns dos quais estão atualmente sob avaliação em estudos clínicos,4,5 ,6.
Ao lado de proteínas, CSF também contém uma abundância de peptídeos endógenos7,8,9,10,11,12. Que constituem produtos de clivagem de muitas proteínas derivado do cérebro, estes peptídeos também representam uma fonte potencialmente importante de biomarcadores da doença. Para aumentar o estoque de peptídeos endógenos identificados no CSF humano e habilitar análises de endopeptidomic CSF em estudos clínicos, foi desenvolvido um método para a preparação da amostra e análise de LC-MS (um esquema de protocolo breve foi incluído na Figura 1 ). A aplicação deste método em um estudo recente resultou na identificação de quase 16.400 endógenos do CSF em amostras de CSF em pool de vários indivíduos de diagnóstico específico, expandindo o conhecido CSF endopeptidome dez vezes13. Opcionalmente, o método pode ser usado em conjunto com a abordagem de rotulagem isobárica para quantificação.
Preparação da amostra
A principal fonte de massa para CSF é constituintes do plasma (por exemplo, albumina e imunoglobulinas) passando por cima do sangue cérebro barreira14,15. Sua abundância elevada dificulta a detecção de componentes de amostra baixa-abundante, derivado do cérebro. Endógenos podem ser facilmente separados de proteínas alta-abundante, permitindo assim que um volume significativamente maior de extrato de peptídeo CSF deve ser usado para análise de LC-MS, permitindo a deteção de peptídeos inferior-abundante.
No protocolo aqui apresentado, filtração de peso molecular de corte (MWCO) foi usada para separar os peptídeos CSF a fração de proteína; um método que tem sido usado em vários anteriores estudos8,9,10,11,12,16. A etapa de filtração foi seguida por uma etapa de pre-fracionamento RP HPLC off-line realizada ao longo de um gradiente de fase móvel de alta-pH. Através da realização de duas etapas de RP HPLC em tandem, com pH, sendo a principal distinção, a diferença de seletividade entre as duas etapas resulta principalmente da retenção de peptídeo alterados em consequência de peptídeo diferentes Estados. O aplicativo de pré-fracionamento alta-pH peptídeo antes da LC-MS, sob condições ácidas provou-se eficiente no aumento do peptide identificação17,18e até mesmo a ser superior para esta finalidade no complexo biológico amostras em relação ao mais separação ortogonais modos19, como o forte gato-íon exchange (SCX) e RP20. Para encurtar o tempo de análise, foi utilizado um esquema de concatenação, reunindo todos os 12th fração (por exemplo, frações 1, 13, 25, 37 e 49), que devido ao poder de alta resolução RP HPLC ainda evitou co eluição de peptídeos de diferentes frações na LC-MS passo20,21.
Identificação de peptídeos
Identificação de peptídeos em estudos peptidomic difere de proteomic estudos em que não há clivagem enzimática pode ser especificada em Pesquisar o banco de dados, e como consequência, as taxas de identificação são geralmente inferior11. Um recente estudo13 mostrou que as taxas de identificação de peptídeos endógenos obtidos com Sequest e mascote foram substancialmente melhoradas quando o padrão marcando o algoritmo do respectivo programa foi modificado usando o marcador adaptável algoritmo de coador, indicando que algoritmos de Pontuação ideais para endógenos diferem de peptídeos tryptic13. Nesse estudo, identificação com base no sequenciamento de péptido automático de novo usando o software picos (BSI) foi encontrado para ser complementares para os motores de busca baseado em impressões digitais de íon dois fragmento, resultando em um conjunto significativamente maior de identificado peptídeos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A introdução de uma etapa de pre-fracionamento RP HPLC alta-pH para um protocolo previamente desenvolvido para recuperação de peptídeos endógenos por peso molecular ultrafiltração11 amostra relativa complexidade reduzida e, assim, permitido para um 5-fold maior volume de amostra a ser estudada. Este, por sua vez, aumentou a concentração do subconjunto de peptídeos presentes em cada fração e melhorado, assim, as chances de detectar baixos peptídeos abundantes.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Muito obrigado a Tanveer Batth e colegas para o Conselho em Configurando o método de pre fracionamento.
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Conselho Sueco de pesquisa, a Margot Wallström e Sjöblom Foundation, a arma e Bertil Stohne Fundação Stiftelse, Fundação Bergwall Magnus, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, o Knut e Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen e FoU-Västra Götalandsregionen.
Os principais beneficiários do financiamento para este projeto foram Kaj Blennow, Henrik Zetterberg e Johan Gobom.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
