ひと脳脊髄液中の Endopeptidomic の分析のための試料作製
Summary
ひと脳脊髄液 (CSF) の内因性ペプチドの質量分析法である. します。分子量カットオフろ過、クロマトグラフィーによる事前分別、質量分析、ペプチドの同定戦略の後の組み合わせを採用し、約 10 倍に比べて知られている CSF ペプチドームを展開することが可能だった先行研究。
Abstract
このプロトコルでは、人間の脳脊髄液 (CSF) の内因性ペプチドを識別する手法について説明します。この目的のため分子量カットオフ (MWCO) ろ過に基づく開発済み、質量分析は、オフラインの高 pH の逆相高速液体クロマトグラフィー事前分別ステップと結合されました。
CSF への分泌は、中枢神経系の細胞に流す分子の除去のための主要な経路です。したがって、中枢神経系の多くのプロセスは、CSF、貴重な診断液、それはレンダリングに反映されます。CSF は、濃度範囲 8-9 桁の蛋白質を含んでいる、複雑な組成を持ちます。タンパク質以外にも先行研究はまた内因性ペプチドの大規模な数の存在を示しています。蛋白質より少なく広く研究、一方、これらのバイオ マーカーとして潜在的な利益可能性がありますも保持します。
内因性ペプチド MWCO のろ過により CSF 蛋白質含量から引き離されてしまいます。サンプルのタンパク質含有量の大半を外して研究サンプル ボリュームとそれによりまた内因性ペプチドの総量を増やすことが可能です。濾過ペプチド混合物の複雑さは、逆相液体クロマトグラフィー質量分析の前にアルカリの ph (RP) 高速液体クロマトグラフィー事前分別ステップを含むで修正されました。分別が結合された分析時間消費は、12 に 60 分画を集めたシンプルな連結方式で、まだほとんど共溶出を避けながらそれにより減る。
3 つの異なるペプチド ・ タンパク質同定ソフトウェア プログラムを使用して、その後結果を組み合わせることによって自動化されたペプチッド同定を行った。別のプログラムは 3 つの間重複 id の 15% 未満に匹敵するのではなく、相補的な.
Introduction
現在、神経変性疾患には、脳脊髄液 (CSF) のバイオ マーカーに研究変形させています。アルツハイマー病、以上 6000 万に影響を与える最も一般的な神経変性疾患の人々 世界中1,2, ペプチド アミロイド ・ ベータ蛋白タウの微小管安定化から成るバイオ マーカーの三重項とリン酸化タウ フォーム、高い感度と特異性、病気を検出することができます診断研究条件3に含まれています。パーキンソン病や多発性硬化症などの他の神経変性疾患におけるプロテオーム研究はいくつかは、現在臨床研究4,5 の評価中、数多くのバイオ マーカー候補を識別しました。、6。
CSF にはタンパク質と一緒に内因性ペプチド7,8,9,10、11,12の豊富さも含まれています。多くの脳由来蛋白質の開裂製品を構成する、これらのペプチドはまた疾患バイオ マーカーの可能性のある重要な源を表します。試料調製及び LC-MS 分析 (簡単なプロトコル スキームに含まれている図 1ひと脳脊髄液で識別された内因性ペプチドの在庫の増加、臨床において CSF endopeptidomic 解析を有効にする方法を開発しました。).最近の研究でこのメソッドのアプリケーションは拡大の既知の CSF endopeptidome 10 倍13非特定診断のいくつかの個人から CSF 標本約 16,400 内因性 CSF ペプチドの同定結果になったメソッドは、定量化の定圧ラベリング手法と組み合わせて必要に応じて使用できます。
サンプル準備
髄液中蛋白質量の主な情報源は血漿成分 (アルブミンや免疫グロブリンなど) 血液脳関門14,15上を通過します。彼らの高い豊富な低豊富で脳由来サンプル コンポーネントの検出を阻害します。内因性ペプチドは、LC-MS 分析、それによって低い豊富なペプチドの検出を有効にするのに使用される CSF ペプチド エキス量が大きくなり、高豊富なタンパク質から容易に分離できます。
ここで提示されたプロトコル、分子量カットオフ (MWCO) ろ過タンパク質端数から CSF ペプチドを分離する使用されました。前のいくつかで使用されているメソッドは、8,9,10、11,12,16を研究します。ろ過ステップは高 pH 移動相勾配上で実行オフラインの RP HPLC 事前分別手順が続いた。主な違いをされている pH タンデムで RP HPLC の 2 つの手順を実行するとして、異なるペプチド電荷状態の結果として変更されたペプチド保持から主に 2 つのステップの選択性の違いの結果します。酸性条件下で LC MS 前に pH が高いペプチド事前分別のアプリケーションは効率的なペプチドの同定の17,18, の増加で、さらに複雑な生物学的にこの目的のために優れている証明します。サンプルより直交分離モード19、強い猫イオン交換 (SCX) や RP20などと比較して。プールごと 12回画 (例えば1、13、25、37、49 分画)、RP hplc 高解像力のためまだ大きく異なる由来ペプチドの共同の溶出を避け、連結スキームが使われます、分析時間を短くにはLC-MS の分数はステップ20,21です。
ペプチドの同定
Peptidomic 研究におけるペプチドの同定とは異なるプロテオーム研究のデータベース検索で酵素胸の谷間は指定できませんし、結果として、識別率が通常より低い11。最近の研究13示した適応の得点を使用してスコアリング アルゴリズム各ソフトウェア プログラムの既定値が変更されたときを Sequest とマスコットを用いる生体内ペプチドの同定率大幅に改良されました。アルゴリズム パーコレーター、生体内ペプチドの最適なスコアリング アルゴリズムがトリプシン ペプチド13のそれと異なることを示します。2 つのフラグメント イオンの指紋ベースの検索エンジンを補完する研究では、ピーク (BSI) ソフトウェアを使用して自動ペプチドde novoシーケンスに基づく識別が見つかったという点での大幅に大きいセットの識別ペプチド。
Protocol
Representative Results
Discussion
分子量限外ろ過11内因性ペプチドの回収率の開発済みプロトコルに高 pH RP HPLC 事前分別ステップの導入相対的なサンプルの複雑さの低減し、5 倍より大きいのそれにより許可サンプル ボリュームを検討します。、これはターンでは、ペプチド各画分に存在のサブセットの濃度を増加し、それにより低豊富なペプチドの検出のチャンスを改善します。
並列…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tanveer Batth や同僚と事前分別方法の設定でのアドバイスに感謝します。
この作品はスウェーデン研究評議会、Wallström、Sjöblom 財団、銃とベルティル Stohne 財団 Stiftelse、マグナス Bergwall 財団、Åhlén 財団、Alzheimerfonden、Demensförbundet、Stiftelsen のためからの資金によって支えられました。ガムラ ・ Tjänarinnor、クヌートとアリス バレンベリー財団、Frimurarestiftelsen、気の狂ったアメリカの Götalandsregionen。
このプロジェクトのための資金の主な受信者はカイ Blennow、ヘンリック ・社会行動」論とヨハン ・ Gobom.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
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