Probenvorbereitung für die Endopeptidomic Analyse im menschlichen Liquor cerebrospinalis
Summary
Eine Methode für die massenspektrometrische Analyse von endogenen Peptiden in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) wird vorgestellt. Durch den Einsatz von Molekulargewicht Cut-off-Filtration, chromatographische Pre-Fraktionierung, massenspektrometrischen Analyse und eine anschließende Kombination von Peptid-Identifikation-Strategien, war es möglich, die bekannten CSF Peptidome fast um das Zehnfache im Vergleich zu erweitern zu früheren Studien.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode entwickelt, um die endogene Peptide in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) zu identifizieren. Zu diesem Zweck eine zuvor entwickelte Methode basierend auf Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Filtration und massenspektrometrische Analyse wurde mit einer offline hohem pH-Wert umgekehrter Phase HPLC Pre Fraktionierung Schritt kombiniert.
Sekretion in Liquor ist der Hauptweg zur Entfernung von Molekülen durch Zellen des zentralen Nervensystems zu vergießen. So spiegeln sich viele Prozesse in das zentrale Nervensystem im Liquor, eine wertvolle diagnostische Flüssigkeit zu rendern. CSF hat eine komplexe Zusammensetzung enthält Proteine, die einen Konzentrationsbereich von 8-9 Größenordnungen umfassen. Neben Proteinen haben frühere Studien auch die Anwesenheit einer großen Anzahl von endogenen Peptiden gezeigt. Während weniger intensiv erforscht als Proteine, können diese auch potentielles Interesse als Biomarker halten.
Endogene Peptide wurden von der CSF Proteingehalt durch MWCO Filtration getrennt. Einen Großteil der Proteingehalt aus der Probe entfernen, ist es möglich, das Probenvolumen studiert und damit auch der Gesamtbetrag der endogene Peptide zu erhöhen. Die Komplexität der Mischung filtriert Peptid wurde behoben, indem unter anderem einen umgekehrten Phase HPLC (RP) Pre-Fraktionierung Schritt bei alkalischen pH-Wert vor der LC-MS-Analyse. Die Fraktionierung wurde kombiniert mit einem einfachen Verkettung Regelung denen 60 Brüche in 12 gebündelt wurden, konnte Analyse Zeitverbrauch dadurch verringert werden, Co Elution noch weitgehend zu vermeiden.
Automatisierte Peptid Identifikation erfolgte durch mit drei verschiedenen Peptid/Protein-Identifikation-Software-Programme und kombinieren anschließend die Ergebnisse. Die verschiedenen Programme wurden ergänzende als vergleichbar mit weniger als 15 % von Identifikationen, die zwischen den drei überlappt.
Introduction
Biomarker im Liquor cerebrospinalis (CSF) sind derzeit verwandelt Forschung in Neurodegenerative Erkrankungen. Bei der Alzheimer-Krankheit die häufigste Neurodegenerative Erkrankung, Auswirkungen auf mehr als 60 Millionen Menschen weltweit1,2, ein Biomarker-Triplett bestehend aus Peptid Amyloid Beta, Mikrotubuli-stabilisierenden Protein Tau, und eine Tau Form phosphoryliert und erkennt die Krankheit mit hoher Sensitivität und Spezifität in der diagnostischen Forschung Kriterien3aufgenommen wurde. In anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson und Multiple Sklerose haben Proteomic Studien zahlreiche Biomarker Kandidaten identifiziert einige davon derzeit unter Bewertung klinischer Studien4,5 sind ,6.
Neben Proteinen enthält CSF auch eine Fülle von endogenen Peptiden7,8,9,10,11,12. Spaltprodukte des Gehirns abgeleitet Proteine bilden, stellen diese Peptide auch eine wichtige Quelle der Krankheit Biomarker. Um das Inventar der identifizierten endogene Peptide in menschlichen CSF zu erhöhen und CSF Endopeptidomic Analysen in klinischen Studien zu ermöglichen, wurde eine Methode entwickelt, für die Probenvorbereitung und LC-MS-Analyse (eine kurze Protokollschema ist in Abbildung 1 aufgenommen worden ). Die Anwendung dieser Methode in einer aktuellen Studie wurden fast 16.400 endogenen CSF Peptide in CSF Mischproben aus mehrere Personen der unspezifischen Diagnose, Erweiterung der bekannten CSF Endopeptidome um das Zehnfache13. Die Methode kann optional in Verbindung mit Isobaren Kennzeichnung Ansatz zur Quantifizierung verwendet werden.
Vorbereitung der Probe
Die wichtigste Quelle für Eiweiß Masse in CSF ist Plasma Bestandteile (z.B. Albumin und Immunglobuline) Überfahren der Blut Hirn-Schranke14,15. Ihre hohe Fülle erschwert die Erkennung von niedrig-reichlich, Brain-derived Beispielkomponenten. Endogene Peptide können leicht von der hohen reichlich Proteine, wodurch ein deutlich größeres Volumen von CSF-Peptid-Extrakt für LC-MS-Analyse, damit die Erkennung der unteren reichlich Peptide verwendet werden getrennt werden.
In dem hier vorgestellten Protokoll wurde Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Filtration verwendet die Proteinfraktion CSF Peptide getrennt; eine Methode, die in mehreren früheren verwendet wurde studiert8,9,10,11,12,16. Der Filtrationsschritt folgte ein offline RP HPLC Pre Fraktionierung Schritt über einen Gradienten von hohem pH-Wert mobilen Phase durchgeführt. Durch Schritten zwei RP HPLC im Tandem, mit pH wird der Hauptunterschied, ergibt sich der Unterschied in Selektivität zwischen den zwei Schritten hauptsächlich aus veränderten Peptid Thesaurierung als Folge unterschiedlicher Peptid Ladungszustände. Die Anwendung von hohem pH-Wert Peptid Pre Fraktionierung vor LC-MS unter sauren Bedingungen nachweislich effizient Peptid Identifikation17,18zu erhöhen und zu diesem Zweck in komplexen biologischen überlegen sein Proben im Vergleich zu mehr orthogonal Trennung Modi19, wie starke Katze-Ionenaustausch (SCX) und RP-20. Um die Analyse zu verkürzen, war eine Verkettung Schema verwendet bündeln alle 12th -Fraktion (z.B. Brüche 1, 13, 25, 37 und 49), die durch das hohe Auflösungsvermögen der RP-HPLC Co Elution von Peptiden aus verschiedenen noch weitgehend vermieden, Brüche in der LC-MS Schritt20,21.
Peptid-Identifikation
Peptid-Identifikation in Peptidomic Studien unterscheidet sich von der Proteomik-Studien, dass kein Enzym Spaltung in die Datenbankrecherche angegeben werden kann, und folglich Identifikation Preise in der Regel niedriger11 sind. Eine aktuelle Studie13 zeigte, dass die Identifizierung Preise für endogene Peptide mit Sequest und Maskottchen erhalten wesentlich verbessert wurden, wenn der Standardwert scoring-Algorithmus des jeweiligen Software-Programm mit der adaptive scoring geändert wurde Algorithmus Percolator, darauf hinweist, dass optimale scoring Algorithmen zur endogenen Peptiden unterscheidet sich von der tryptic Peptide13. Studie, Identifikation anhand automatischer Peptid de Novo Sequenzierung mit Hilfe der Software PEAKS (BSI) Ergänzend zu den zwei Fragment Ion fingerprinting-basierten Suchmaschinen gefunden wurde, identifiziert, wodurch eine erheblich größere Anzahl von Peptide.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Einführung eines hohem pH-Wert RP HPLC Pre Fraktionierung Schritts auf ein zuvor entwickelte Protokoll für die Wiederherstellung von endogenen Peptiden durch Molekulargewicht Ultrafiltration11 relative Probe Komplexität reduziert und dadurch für eine 5-fach größere erlaubt Probenvolumen untersucht werden. Dies wiederum erhöht die Konzentration der Teilmenge von Peptiden in jede Fraktion vertreten und dadurch verbessert die Chancen auf Erkennung von niedrigen reichlich Peptide.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vielen Dank an Tanveer Batth und Kollegen für die Beratung bei der Einrichtung der Pre-Fraktionierung-Methode.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel vom schwedischen Forschungsrat, der Wallström und Sjöblom Foundation, die Waffe und Bertil Stohne Stiftung Stiftelse, Magnus Bergwall Stiftung, Åhlén Stiftung, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut und Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen und FoU Västra Götalandsregionen.
Die wichtigsten Empfänger von Zuschüssen für dieses Projekt waren Kaj Blennow, Henrik Zetterberg und Johan Gobom.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
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