मानव मस्तिष्कमेरु द्रव में Endopeptidomic विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
Summary
मानव मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में अंतर्जात पेप्टाइड्स के मास spectrometric विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत है । आणविक वजन कट-छानने का काम, क्रोमेटोग्राफिक पूर्व भिन्नीकरण, जन spectrometric विश्लेषण और पेप्टाइड पहचान रणनीतियों के एक अनुवर्ती संयोजन को रोजगार से, यह ज्ञात सीएसएफ peptidome विस्तार करने के लिए संभव था लगभग दस गुना की तुलना में पिछले अध्ययन करने के लिए ।
Abstract
यह प्रोटोकॉल मानव मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में अंतर्जात पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए विकसित विधि का वर्णन करता है । इस प्रयोजन के लिए, एक पहले से विकसित आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) निस्पंदन और मास spectrometric विश्लेषण के आधार पर विधि एक ऑफ़लाइन उच्च पीएच रिवर्स चरण HPLC पूर्व अंश कदम के साथ संयुक्त था ।
सीएसएफ में स्राव केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की कोशिकाओं द्वारा बहाया अणुओं को हटाने के लिए मुख्य मार्ग है । इस प्रकार, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में कई प्रक्रियाओं सीएसएफ में परिलक्षित होते हैं, यह एक मूल्यवान नैदानिक द्रव प्रतिपादन । सीएसएफ एक जटिल संरचना है, युक्त प्रोटीन है कि परिमाण के 8-9 आदेश की एक एकाग्रता रेंज अवधि । प्रोटीन के अलावा, पिछले अध्ययनों ने भी अंतर्जात पेप्टाइड्स की एक बड़ी संख्या की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है । जबकि कम बड़े पैमाने पर प्रोटीन की तुलना में अध्ययन किया, ये भी के रूप में संभावित ब्याज पकड़ सकता है ।
अंतर्जात पेप्टाइड्स MWCO निस्पंदन के माध्यम से सीएसएफ प्रोटीन सामग्री से अलग किया गया । नमूना से प्रोटीन सामग्री के बहुमत को दूर करके, यह नमूना मात्रा का अध्ययन किया है और इस तरह के अंतर्जात पेप्टाइड्स की कुल राशि को बढ़ाने के लिए संभव है. निस्पंदन पेप्टाइड मिश्रण की जटिलता एक रिवर्स चरण सहित द्वारा संबोधित किया गया था (आरपी) क्षारीय पीएच पर HPLC पूर्व आंशिक कदम नियंत्रण रेखा से पहले-एमएस विश्लेषण. भिन्नीकरण एक साधारण संयोजन योजना के साथ संयुक्त किया गया था जहां ६० अंश 12 में जमा किए गए थे, विश्लेषण समय की खपत को इस प्रकार कम किया जा सकता है जबकि अभी भी काफी हद तक सह-रेफरेंस से परहेज है ।
स्वचालित पेप्टाइड पहचान तीन अलग पेप्टाइड/प्रोटीन पहचान सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके किया गया था और बाद में परिणामों के संयोजन । विभिंन कार्यक्रमों के बजाय पूरक थे तीन के बीच छा पहचान के कम से 15% के साथ तुलनीय ।
Introduction
मस्तिष्कमेरु द्रव में (सीएसएफ) वर्तमान में अनुसंधान neurodegenerative विकारों में बदल रहे हैं । अल्जाइमर रोग में, सबसे आम neurodegenerative विकार, दुनिया भर में ६०,०००,००० से अधिक लोगों को प्रभावित करने1,2, एक triplet पेप्टाइड amyloid बीटा, microtubule-स्थिर प्रोटीन ताऊ से मिलकर, और एक phosphorylated तौ रूप, उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ रोग का पता लगा सकते हैं, और नैदानिक अनुसंधान मानदंडों में शामिल किया गया है3। अन्य neurodegenerative रोगों में, जैसे पार्किंसंस रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस, proteomic अध्ययनों ने कई विमार्की उंमीदवारों की पहचान की है, जिनमें से कुछ में वर्तमान में मूल्यांकन के तहत नैदानिक अध्ययन4,5 ,6.
प्रोटीन के साथ, सीएसएफ भी अंतर्जात पेप्टाइड्स की एक बहुतायत7,8,9,10,11,12शामिल हैं । कई मस्तिष्क व्युत्पंन प्रोटीन के क्लीवेज उत्पादों का गठन, इन पेप्टाइड्स भी रोग के एक संभावित महत्वपूर्ण स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । मानव सीएसएफ में पहचान अंतर्जात पेप्टाइड्स की सूची को बढ़ाने और नैदानिक अध्ययन में सीएसएफ endopeptidomic विश्लेषण सक्षम करने के लिए, एक विधि नमूना तैयारी और नियंत्रण रेखा के लिए विकसित किया गया था-एमएस विश्लेषण (एक संक्षिप्त प्रोटोकॉल योजना चित्रा 1 में शामिल किया गया है ). हाल के एक अध्ययन में इस विधि के आवेदन गैर विशिष्ट निदान के कई व्यक्तियों से परित सीएसएफ के नमूनों में लगभग १६,४०० अंतर्जात सीएसएफ पेप्टाइड्स की पहचान के परिणामस्वरूप, ज्ञात सीएसएफ endopeptidome दस गुना का विस्तार13. विधि वैकल्पिक रूप से ठहराव के लिए isobaric लेबलिंग दृष्टिकोण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
नमूना तैयारी
सीएसएफ में प्रोटीन द्रव्यमान का मुख्य स्रोत प्लाज्मा घटक (जैसे एल्ब्युमिन और इम्युनोग्लोबुलिन) रक्त मस्तिष्क बाधा14,15से अधिक गुजर रहा है । उनके उच्च बहुतायत कम प्रचुर मात्रा में, मस्तिष्क व्युत्पंन नमूना घटकों का पता लगाने में बाधा । अंतर्जात पेप्टाइड्स आसानी से उच्च प्रचुर मात्रा में प्रोटीन से अलग किया जा सकता है, जिससे सीएसएफ पेप्टाइड निकालने का एक काफी बड़ा खंड की अनुमति के लिए नियंत्रण रेखा के लिए इस्तेमाल किया जा एमएस विश्लेषण, जिससे कम प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड्स का पता लगाने को सक्षम करने.
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) निस्पंदन प्रोटीन अंश से सीएसएफ पेप्टाइड्स अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; एक विधि है कि कई पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है8,9,10,11,12,16। निस्पंदन कदम एक ऑफ़लाइन आरपी HPLC पूर्व भिन्नीकरण एक उच्च पीएच मोबाइल चरण ढाल पर प्रदर्शन कदम के बाद किया गया था । मिलकर में दो आरपी HPLC कदम प्रदर्शन करके, पीएच मुख्य अंतर होने के साथ, दो कदम के बीच selectivity में अंतर मुख्य रूप से अलग पेप्टाइड प्रभारी राज्यों के एक परिणाम के रूप में बदल पेप्टाइड प्रतिधारण से परिणाम. उच्च पीएच पेप्टाइड के आवेदन पूर्व-भिन्नीकरण से पहले नियंत्रण रेखा-अम्लीय स्थितियों के तहत एमएस में पेप्टाइड पहचान बढ़ाने में कुशल साबित हुआ है17,18, और यहां तक कि जटिल जैविक में इस प्रयोजन के लिए बेहतर हो इस तरह के मजबूत बिल्ली आयन एक्सचेंज (SCX) और आरपी20के रूप में और अधिक ओर्थोगोनल जुदाई मोड19की तुलना में नमूने । विश्लेषण समय को छोटा करने के लिए, एक संयोजन योजना का इस्तेमाल किया गया था, हर 12वें अंश (उदा., 1, 13, 25, ३७, और ४९ अंश), जो आरपी HPLC की उच्च संपति शक्ति के कारण अभी भी काफी हद तक बचा-अलग से पेप्टाइड्स के सह-रेफरेंस को टाल दिया नियंत्रण रेखा में भिंन-MS चरण20,21।
पेप्टाइड पहचान
peptidomic अध्ययन में पेप्टाइड पहचान कि कोई एंजाइम दरार डेटाबेस खोज में निर्दिष्ट किया जा सकता है कि में proteomic अध्ययनों से अलग है, और एक परिणाम के रूप में, पहचान दर आमतौर पर कम कर रहे हैं11. हाल के एक अध्ययन13 से पता चला कि अंतर्जात पेप्टाइड्स Sequest और शुभंकर के साथ प्राप्त के लिए पहचान दरों में काफी सुधार हुआ जब डिफ़ॉल्ट संबंधित सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का स्कोरिंग एल्गोरिथ्म अनुकूली स्कोरिंग का उपयोग कर संशोधित किया गया था एल्गोरिथ्म अंतर्जात पेप्टाइड्स के लिए इष्टतम स्कोरिंग एल्गोरिथ्म जो इंगित करता है, जो tryptic पेप्टाइड्स के13से अलग है । उस अध्ययन में, पहचान स्वचालित पेप्टाइड de नोवो अनुक्रमण के आधार पर सॉफ्टवेयर चोटियों (बीएसआई) का उपयोग करने के लिए दो टुकड़ा आयन फिंगरप्रिंटिंग आधारित खोज इंजन, की पहचान की एक काफी बड़ा सेट में जिसके परिणामस्वरूप के पूरक होना पाया गया पेप्टाइड्स.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक उच्च पीएच की शुरूआत आरपी HPLC पूर्व-भिंन आणविक वजन ultrafiltration द्वारा अंतर्जात पेप्टाइड्स की वसूली के लिए एक पहले से विकसित प्रोटोकॉल के लिए कदम के सापेक्ष नमूना जटिलता कम है और इस तरह एक 5 गुना बड़ा के लिए अन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
नक्वी Batth और सहकर्मियों को पूर्व-भिन्नता विधि स्थापित करने में सलाह के लिए बहुत धन्यवाद.
इस काम को स्वीडिश रिसर्च काउंसिल, द Wallström ऐंड Sjöblom फाउंडेशन, द गन एंड Bertil Stohne फाउंडेशन Stiftelse, द मैगनस Bergwall फाउंडेशन, द Åhlén फाउंडेशन, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för से फंडिंग द्वारा सपोर्ट किया गया । Gamla Tjänarinnor, द Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन, Frimurarestiftelsen, और FoU-Västra Götalandsregionen ।
इस परियोजना के लिए धन के मुख्य प्राप्तकर्ताओं क२ज Blennow, Henrik Zetterberg और जोहान Gobom थे ।
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
