Eksempel forberedelse til Endopeptidomic analyse i menneskelig Cerebrospinalvæske
Summary
En metode for masse spectrometric analyse av endogene peptider i menneskelig cerebrospinalvæske (CSF) vises. Ved å bruke molekylvekt cut-off filtrering, brukt kromatografiske før fraksjoneres, masse spectrometric analyse og en påfølgende kombinasjon av peptid identifikasjon strategier, var det mulig å utvide den kjente CSF peptidome nesten ti-fold sammenlignet tidligere studier.
Abstract
Denne protokollen beskriver en metode utviklet for å identifisere endogene peptider i menneskelig cerebrospinalvæske (CSF). For dette formålet, en tidligere utviklet metode basert på molekylvekt cut-off (MWCO) filtrering og masse spectrometric analyse ble kombinert med en frakoblet høy pH omvendt fase HPLC pre fraksjoneres trinn.
Sekresjon i CSF er den viktigste veien for fjerning av molekyler skur av celler i det sentrale nervesystemet. Dermed gjenspeiles mange prosesser i sentralnervesystemet i CSF, gjengi det en verdifull diagnostiske væske. CSF har en sammensatt komposisjon, som inneholder proteiner som dekker mange konsentrasjon av 8-9 størrelsesordener. Foruten proteiner, har tidligere studier også vist tilstedeværelsen av et stort antall endogene peptider. Mens mindre grundig studert enn proteiner, kan dette også holde interesse som biomarkers.
Endogene peptider ble skilt fra CSF proteininnholdet gjennom MWCO filtrering. Ved å fjerne et flertall av proteininnhold fra prøven, er det mulig å øke eksempel volumet studerte og dermed også totalbeløpet av endogene peptider. Kompleksiteten i filtrert peptid blandingen ble behandlet ved å inkludere en omvendt fase (RP) HPLC pre fraksjoneres trinn på alkaliske pH før LC-MS analyse. Fraksjoneres ble kombinert med en enkel sammenkjeding ordning der 60 fraksjoner var samlet i 12, analyse tidsforbruk kan dermed reduseres og fortsatt i stor grad unngå co elueringsrør.
Automatisert peptid identifikasjon ble utført ved hjelp av tre forskjellige peptid/protein identifikasjon programmer og deretter kombinere resultatene. De ulike programmene var utfyllende heller enn sammenlignbare med mindre enn 15% av identifikasjoner overlappet mellom tre.
Introduction
Biomarkers i cerebrospinalvæske (CSF) er for tiden transformere forskning til nevrodegenerative lidelser. I Alzheimers sykdom, de vanligste nevrodegenerative lidelsen, påvirker over 60 millioner mennesker verden over1,2, en biomarkør trilling bestående av peptid amyloid beta, microtubule-stabilisere protein tau, og fosforylert tau skjemaet kan oppdage sykdommen med høy sensitivitet og spesifisitet og er inkludert i diagnostiske forskning kriterier3. I andre nevrodegenerative sykdommer, som Parkinsons sykdom og multippel sklerose, har proteomic studier identifisert flere biomarkør kandidater, hvorav noen er for tiden under evaluering i kliniske studier4,5 ,6.
Sammen med proteiner inneholder CSF også en overflod av endogene peptider7,8,9,10,11,12. Disse peptider utgjør cleavage produkter av mange hjerne-avledet proteiner, og representerer også en potensielt viktig kilde av sykdom biomarkers. For å øke beholdningen av identifiserte endogene peptider i menneskelig CSF og aktivere CSF endopeptidomic analyser i kliniske studier, utviklet en metode for eksempel forberedelse og LC-MS analyse (en kort Protokollskjemaet har blitt inkludert i figur 1 ). Anvendelsen av denne metoden i en fersk studie resulterte i identifikasjon av nesten 16,400 endogene CSF peptider i grupperte CSF prøver fra flere personer i ikke-spesifikk diagnose, utvide den kjente CSF endopeptidome tidoble13. Metoden kan eventuelt brukes i forbindelse med isobar merking tilnærming for kvantifisering.
Eksempel forberedelse
Den viktigste kilden til protein masse CSF er plasma bestanddeler (albumin og immunglobuliner) forbi blod hjernen barriere14,15. Deres høy overflod vanskeliggjør påvisning av lav-rikelig, hjerne-avledet eksempel komponenter. Endogene peptider kan lett skilles fra høy-rikelig proteiner, og dermed slik at et betydelig større volum av CSF peptid ekstrakt som skal brukes for LC-MS analyse, og dermed gjør påvisning av lavere-rikelig peptider.
I protokollen presenteres her, ble molekylvekt cut-off (MWCO) filtrering brukt til å skille CSF peptider fra protein fraksjon; en metode som har blitt brukt i flere tidligere studier8,,9,,10,,11,,12,,16. Filtrering trinnet ble etterfulgt av en frakoblet RP HPLC pre fraksjoneres trinn utført over høy pH mobile fase gradering. Ved å utføre to RP HPLC trinn i tandem, med pH blir den største forskjellen, forskjellen i selektivitet mellom de to trinnene skyldes hovedsakelig endret peptid oppbevaring av ulike peptid kostnad stater. Bruk av høy-pH peptid pre fraksjoneres før LC-MS Sure forhold har vist seg effektiv i øke peptid identifikasjon17,18, og selv å være overlegen for dette formålet i komplekse biologiske prøver i forhold til mer ortogonale separasjon modus19, som sterke katten-ion exchange (SCX) og RP20. Til forkorte tiden analyse, ble en sammenkobling ordningen brukt, samle alle 12th brøkdel (f.eks, brøker 1, 13, 25, 37 og 49) som på grunn av høy løse makt RP HPLC fortsatt i stor grad unngått co elueringsrør av peptider fra forskjellige brøker i LC-MS trinn20,21.
Peptid identifikasjon
Peptid identifikasjon i peptidomic studier er forskjellig fra proteomic studier i at noen enzym cleavage kan angis søk i databasen, og som en konsekvens, identifikasjon priser er vanligvis lavere11. En fersk studie13 viste at de identifikasjon prisene for endogene peptider med Sequest og maskott ble betydelig forbedret når standard scoring algoritme av respektive programmet ble endret ved hjelp av adaptiv scoring algoritmen kaffetrakter, som angir at optimal scoring algoritmer for endogene peptider avvike fra det tryptic peptider13. At studien identifikasjon basert på automatisk peptid de novo sekvensering programmvre TOPPER (BSI) ble funnet for å være utfyllende til to fragment ion fingeravtrykk-baserte søkemotorer, identifisert som resulterer i et betydelig større antall peptider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Innføringen av en høy-pH RP HPLC pre fraksjoneres trinn til en tidligere utviklet protokoll for utvinning av endogene peptider ved molekylvekt ultrafiltrasjon11 redusert relative eksempel kompleksitet og tillatt dermed for 5-fold større eksempel volum studier. Dette, i sin tur økt konsentrasjonen av undergruppe av peptider i hver fraksjon og bedre dermed sjansene for å oppdage lav rikelig peptider.
Ved å utføre en identifikasjon strategi for endogene peptider som…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mange takk til Tanveer Batth og kolleger for råd konfigurere metoden før fraksjoneres.
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra svenske Forskningsrådet, Wallström og Sjöblom Foundation, pistolen og Bertil Stohne Foundation Stiftelse, Magnus Bergwall Foundation, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen for Gamla Tjänarinnor, Knut og Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen og FoU-Västra Götalandsregionen.
De viktigste mottakerne av midler til dette prosjektet var Kaj Blennow, Henrik Zetterberg og Johan Gobom.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
