En metod för massa spektrometriska analys av endogena peptider i mänskliga cerebrospinalvätska (CSF) presenteras. Genom att anställa molekylvikt cut-off filtrering, kromatografiska före fraktionering, massa spektrometriska analys och en efterföljande kombination av peptid identifiering strategier, var det möjligt att expandera den kända CSF peptidome nästan tio gånger jämfört till tidigare studier.
Det här protokollet beskriver en metod som utvecklats för att identifiera endogena peptider i mänskliga cerebrospinalvätska (CSF). För detta ändamål, en tidigare utvecklade metod baserad på molekylvikt cut-off (MWCO) filtrering och massa spektrometriska analys kombinerades med ett offline hög-pH omvänd fas HPLC före fraktionering steg.
Sekretion i CSF är den viktigaste smittvägen för borttagning av molekyler skjul av celler i det centrala nervsystemet. Således återspeglas många processer i det centrala nervsystemet i CSF, gör den en värdefull diagnostisk vätska. CSF har en komplex sammansättning, som innehåller proteiner som sträcker sig över ett koncentrationsintervall 8-9 storleksordningar. Förutom proteiner, har tidigare studier också påvisat förekomsten av ett stort antal endogena peptider. Medan mindre flitigt studerade än proteiner, kan dessa också hålla potentiella intresse som biomarkörer.
Endogena peptider skildes från CSF proteinhalten genom MWCO filtrering. Genom att ta bort en majoritet av proteinhalten från provet, är det möjligt att öka den provvolymen studerade och därmed också det totala beloppet för de endogena peptiderna. Komplexiteten i filtermediat peptid blandningen åtgärdades genom att inkludera en omvänd fas (RP) HPLC före fraktionering steg vid alkaliskt pH före LC-MS-analys. Fraktioneringen kombinerades med en enkel sammanfogning stödordning där 60 fraktioner var poolade in 12, analys tidsförbrukning skulle därmed kunna minskas medan fortfarande i stor utsträckning undvika samtidig eluering.
Automatiserad peptid identifiering utfördes med hjälp av tre olika peptid och protein identifiering programvara program och därefter kombinerar resultaten. De olika programmen var kompletterande snarare än jämförbara med mindre än 15% av identifiering av överlappade mellan tre.
Biomarkörer i ryggmärgsvätska (CSF) för närvarande omvandla forskning till neurodegenerativa sjukdomar. I Alzheimers sjukdom, den vanligaste neurodegenerativa sjukdomar, som påverkar över 60 miljoner människor världen över1,2, en biomarkör triplet bestående av peptid amyloid beta, mikrotubuli-stabiliserande proteinet tau, och en fosforyleras tau form, kan upptäcka sjukdomen med hög känslighet och specificitet och har inkluderats i den diagnostiska forskning kriterier3. I andra neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom och multipel skleros, har proteomiska studier identifierat ett flertal biomarkör kandidater, av vilka några är för närvarande under utvärdering i kliniska studier4,5 ,6.
Tillsammans med proteiner innehåller CSF också ett överflöd av endogena peptider7,8,9,10,11,12. Som utgör klyvningsprodukter av många brain-derived proteiner, representera dessa peptider också en potentiellt viktig källa av sjukdom biomarkörer. För att öka lagret av identifierade endogena peptider i human CSF och aktivera CSF endopeptidomic analyser i kliniska studier, utvecklades en metod för provberedning och LC-MS-analys (ett kort protokoll system har inkluderats i figur 1 ). Tillämpningen av denna metod i en färsk studie resulterade i identifiering av nästan 16,400 endogena CSF peptider i CSF samlingsprover från flera individer av icke-specifik diagnos, expanderar den kända CSF endopeptidome tiofaldig13. Metoden kan eventuellt användas tillsammans med isobariska märkning metod för kvantifiering.
Provberedning
Den huvudsakliga källan till protein massan i CSF är plasma beståndsdelar (e.g. albumin och immunglobuliner) passerar över de blod hjärn barriären14,15. Deras höga överflöd försvårar upptäckten av låg-riklig, brain-derived urval komponenter. Endogena peptider kan lätt separeras från hög-riklig proteinerna, vilket innebär att en betydligt större volym CSF peptid extrakt användas för LC-MS analys, vilket möjliggör detektering av nedre-riklig peptider.
I protokollet presenteras här, användes molekylvikt cut-off (MWCO) filtrering för att skilja de CSF peptiderna från proteinfraktion; en metod som har använts i flera tidigare studier8,9,10,11,12,16. Det filtrering steget följdes av en offline RP HPLC före fraktionering steg utförs över en hög-pH mobil fas övertoning. Genom att utföra två RP HPLC steg parallellt, med pH är den huvudsakliga skillnaden, skillnaden i selektivitet mellan de två stegen resultat främst från förändrad peptid innehållande till följd av olika peptid laddningstillstånd. Tillämpningen av hög-pH peptid före fraktionering före LC-MS under sura förhållanden har visat sig vara effektiv för att öka peptid identifiering17,18, och även att vara överlägsen för detta ändamål i komplexa biologiska prover jämfört med mer ortogonala separation lägen19, såsom stark katt-jonbyte (SCX) och RP20. För att förkorta tid som analys, användes en sammanfogning systemet, sammanslagning varje 12th bråkdel (t.ex., bråk 1, 13, 25, 37 och 49), som på grund av hög lösa driver av RP HPLC fortfarande till stor del undvikas samtidig eluering av peptider från olika fraktioner i LC-MS steg20,21.
Peptid identifiering
Peptid identifiering i peptidomic studier skiljer sig från proteomiska studier däri ingen enzym klyvning kan anges i databasen sökningen, och följaktligen identifiering priser är oftast lägre11. En senare studie13 visade att de identifiering priserna för endogena peptider erhålls med Sequest och maskot förbättrades avsevärt när standard scoring algoritm av respektive programmet ändrades använder adaptiv scoring algoritmen bryggare, som visar att optimal scoring algoritmer för endogena peptider skiljer sig från tryptic peptider13. Genom att studien identifiering baserat på automatisk peptid de novo sekvensering med programvaran toppar (BSI) befanns vara ett komplement till de två fragment ion fingeravtryck-baserade sökmotorerna, identifieras vilket resulterar i en betydligt större uppsättning peptider.
Införandet av ett hög-pH RP HPLC före fraktionering steg till ett tidigare utvecklade protokoll för återvinning av endogena peptider med molekylvikt ultrafiltrering11 minskad relativ prov komplexitet och möjliggjorde därmed en 5 gånger större provvolymen studeras. Detta, i sin tur ökade koncentrationen av delmängden av peptider i respektive fraktion och förbättrat därmed chanserna att upptäcka låg rikligt peptider.
Genom att utföra en identifiering stra…
The authors have nothing to disclose.
Stort tack Tanveer Batth och kolleger om råd i ställa in metoden före fraktionering.
Detta arbete stöds av finansiering från Vetenskapsrådet, Wallström och Sjöblom Foundation, Gun och Bertil Stohne Foundation Stiftelse, Stiftelsen Magnus Bergwall, Åhlén-stiftelsen, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla bidrag, Knut och Alice Wallenbergs stiftelse, Frimurarestiftelsen, och FoU-Västra Götalandsregionen.
De huvudsakliga mottagarna av finansiering för detta projekt var Kaj Blennow, Henrik Zetterberg och Johan Gobom.
1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |