In Vivo Bijhouden van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen in een Rat knie artrose Model met fluorescerende lipofiele membraan kleurstof
Summary
Dit protocol beschrijft een efficiënte manier om te controleren de cel persistentie en ook menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) door far-red fluorescentie labeling in een rat knie artrose (KOA) model via intra-articulaire (IA) injectie.
Abstract
Ter ondersteuning van de klinische toepassing van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSC) therapie voor knie artrose (KOA), onderzochten we de werkzaamheid van cel persistentie en ook van haMSCs in diermodellen. We toonden een methode om de celmembraan van haMSCs met lipofiele fluorescente kleurstof van een label. Intra-articulaire injectie van de gelabelde cellen bij ratten met chirurgisch geïnduceerde KOA werd vervolgens dynamisch gecontroleerd door een in vivo imaging systeem. We gebruikt de lipofiele carbocyanines deed (DilC18 (5)), een far-red analoge tuners fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) en die een rode laser gebruikt Voorkom excitatie van de natuurlijke groene autofluorescence uit de omliggende weefsels. Voorts de rood-verschoven emissie spectra van toegestaan diep-weefsel beeldvorming in levende dieren en de labeling procedure veroorzaakt geen cytotoxische effecten of functionele schade aan haMSCs. Deze aanpak is aangetoond dat een efficiënte tracking methode voor haMSCs in een rat KOA model. De toepassing van deze methode kan ook worden gebruikt om te bepalen van de optimale administratie route en de dosering van MSCs uit andere bronnen in de pre-klinische studies.
Introduction
Knie artrose (KOA) is een degeneratieve aandoening als gevolg van verlies van de articulaire kraakbeen en progressieve ontsteking, die uitgegroeid een grote chronische ziekte bij ouderen rond de wereld1 tot is. Huidige therapieën met anti-inflammatoire geneesmiddelen, fysieke supplementen en chirurgische procedures kunnen echter alleen tijdelijke verlichting voor symptomatische pijn2.
Menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) geworden een veelbelovende regeneratieve remedie tegen artrose van de knie, als gevolg van hun multipotente differentiatie mogelijkheden voor regeneratie van het kraakbeen en immunomodulerende eigenschappen3, 4. Vergeleken met farmacologische routes naar mechanismen van actie in vivoonderzoeken, is het bijhouden van levende haMSCs in kleine KOA diermodellen momenteel leerzaam om vast te stellen van de redenen voor en de haalbaarheid van haMSC therapie voorafgaand aan klinische toepassing. Voor preklinische testen, destabiliseert mediale meniscectomy (MM) de mechanische belasting van het gewricht te bewegen KOA in ratten, waarmee een relatief haalbaar model met consistente reproduceerbaarheid5. Het begin van de KOA geïnduceerd door MM is lager dan voorste cruciate ligament transect alleen of in combinatie met gedeeltelijke mediale meniscectomy6. De langdurige interacties tussen ingespoten haMSCs met de pathologische communicatie van KOA worden daarom vaak bij ratten geïnduceerd door MM7,8beoordeeld.
De therapeutische werking van haMSCs is uitgebreid gerapporteerd, relevante kennis op wel de in vivo persistentie van geïmplanteerde haMSCs via intra-articulaire (IA) injectie schaars9,10. Vandaar, diverse cellulaire labeling methoden zijn ontwikkeld, met inbegrip van de immunohistology11, luciferase12, groen fluorescent proteïne13 transfectie, ijzeroxide labeling voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI)14 , en talrijke fluorescerende cel kleurstoffen8,15,16. Vergeleken met de arbeidsintensieve histologie analyses, in vivo niet-invasieve imaging maakt gebruik van optische apparaten te detecteren de real-time verdeling en dynamiek van cellen die zijn gelabeld met de fluorescerende signalen10,17. Voor functionele levende cel imaging is cytocompatible TL labeling een geavanceerd radioactieve-gratis tracking techniek te onthullen van cellulaire activiteiten na stamcel transplantatie18. Multicolor fluorescente lipofiele kleurstoffen bezitten bovendien voordelen ten opzichte van amino-reactieve hydrofiele kleurstoffen of fluorescerende eiwitten, met inbegrip van hun verbeterde cel permeabiliteit en verbeterde fluorescentie quantum opbrengsten19.
Dus de hier opgenomen protocollen gebruiken een rode laser te prikkelen van cellen die zijn gemarkeerd met de lipofiele carbocyanines deed (DilC,18lid 5), die is een far-red fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analoge20. De rood-verschoven excitatie en emissie spectra van vermijdt autofluorescent interferentie en diep-weefsel imaging gedurende een lange periode van tijd in levende dieren8staat. Deze methode van tracking cellen in vivo aangeduid met deed is geldig voor de controle van de getransplanteerde cellen van de stam, zoals haMSCs, in diermodellen, die is essentieel om te begrijpen en te verbeteren huidige regeneratieve therapie van de stamcel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veiligheidsnormen en ook studies van stamcel therapie zijn dringend nodig voordat we regeneratieve stamcel behandeling voor KOA van de Bank aan het bed brengen kunnen. Echter, het pathologische milieu van ziekte speelt een belangrijke rol in de persistentie en ook van getransplanteerde haMSCs10. Onlangs, heeft onze fractie aangetoond dat intra-articulaire injectie van haMSCs bleef langer in een pathologische KOA omgeving dan injecties onder normale omstandigheden8deed. Het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De huidige studie werd ondersteund door het Shanghai innovatiefinanciering (1402H 294300) gesponsord door de wetenschap en de technologie Commissie van Shanghai gemeente (CN) aan Dr. Wen Wang. Wij wil Dr Guangdong Zhou (nationale Tissue Engineering Center van China) bedanken voor zijn technische bijstand en de wetenschappelijke adviezen voor dit manuscript. Wij ook bedank Mr. Huitang Xia (Shanghai negende Volksgeschiedenis ziekenhuis) voor zijn hulp bij het welzijn van dieren.
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin, , et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
