Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

Summary

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

Abstract

Para oferecer suporte a aplicação clínica da terapia humana adiposo-derivados mesenquimais células-tronco (haMSC) para osteoartrite do joelho (KOA), examinamos a eficácia da persistência de célula e biodistribuição de haMSCs em modelos animais. Demonstrámos um método para rotular a membrana da célula de haMSCs com corante lipofílico fluorescente. Posteriormente, injeção intra-articular das pilhas etiquetadas em ratos com KOA cirurgicamente induzida dinamicamente foi monitorada por um na vivo sistema de imagem. Utilizamos o lipofílico carbocyanines fez (DilC₁₈ (5)), um análogo de Dil (dialkylcarbocyanines) far-red fluorescente, que utilizou um laser vermelho para evitar a excitação da autofluorescência verde natural dos tecidos circundantes. Além disso, os espectros de emissão avermelhado de permitiu a imagem do profundo-tecido de animais vivos e o processo de rotulagem não causaram nenhum efeitos citotóxicos ou dano funcional ao haMSCs. Esta abordagem tem demonstrada ser um método de controle eficiente para haMSCs em um modelo do rato KOA. A aplicação deste método também pode ser usada para determinar a rota ideal de administração e dosagem de MSCs provenientes de outras fontes em estudos pré-clínicos.

Introduction

Osteoartrose do joelho (KOA) é uma doença degenerativa resultante da perda de cartilagem articular e inflamação progressiva, que se tornou das principais doenças crônica em idosos ao redor do mundo¹. No entanto, terapias atuais usando anti-inflamatórios, suplementos de físicos e procedimentos cirúrgicos somente podem proporcionar alívio temporário para sintomáticos dor².

Adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) tornaram-se um remédio promissor regenerativo para osteoartrite do joelho, devido à sua diferenciação multipotent potencial para regeneração de cartilagem e imunomoduladores propriedades^{3, 4}. Comparado com rotas farmacológicas para investigar os mecanismos de ação na vivo, acompanhamento ao vivo haMSCs em modelos animais de pequeno KOA é atualmente instrutivo para estabelecer a fundamentação e a viabilidade da terapia haMSC antes da aplicação clínica. Para testes pré-clínicos, meniscectomia medial (MM) desestabiliza a carga mecânica da articulação para induzir KOA em ratos, que fornece um modelo relativamente viável com reprodutibilidade consistente⁵. O aparecimento de KOA induzida por MM é anterior à transecção do ligamento cruzado anterior, sozinha ou combinada com meniscectomia medial parcial⁶. Portanto, as longo prazo interações entre haMSCs injetado com o microambiente patológica de KOA frequentemente são avaliadas em ratos induzidos por MM^7,8.

Embora a eficácia terapêutica de haMSCs tem sido amplamente relatado, relevante o conhecimento sobre a persistência na vivo do haMSCs implantado através de injeção intra-articular de (IA) é escasso^9,10. Assim, vários métodos de rotulagem celulares foram desenvolvidos, incluindo immunohistology¹¹luciferase¹², transfecção de¹³ proteína verde fluorescente, óxido de ferro, rotulagem por ressonância magnética (MRI)¹⁴ e numerosas células fluorescentes corantes^8,15,16. Em comparação com análises de trabalho intensivo de histologia, na vivo não-invasivo imagem emprega dispositivos ópticos para detectar a distribuição em tempo real e a dinâmica das células rotuladas com sinais fluorescentes^10,17. Para a imagem latente funcional de células vivas, cytocompatible fluorescente rotulagem é uma técnica de rastreamento sofisticado radioativo livre para revelar atividades celulares após transplante de células-tronco¹⁸. Além disso, multicoloridos fluorescentes corantes lipofílicos possuem vantagens sobre amino-hidrofílicos corantes ou proteínas fluorescentes, incluindo sua permeabilidade celular melhorada e reforçada fluorescência quântica rendimentos¹⁹.

Assim, os protocolos incluídos aqui utilizam um vermelho laser para excitar as células rotuladas com carbocyanines lipofílicos fez (DilC₁₈(5)), que é um far-red fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analógico²⁰. Os espectros avermelhado da excitação e emissão de evita a interferência de autofluorescent e permite que a imagem latente durante um longo período de tempo em animais vivos⁸tecidos profundos. Esse método de rastreamento de células na vivo rotulado com que é válido para monitoramento transplantadas células-tronco, tais como haMSCs, em modelos animais, que é essencial para compreender e melhorar a atual terapia regenerativa de células-tronco.

Protocol

procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética e local institucional Animal conta com um esforço para minimizar o sofrimento dos animais. O seguinte protocolo foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) em Shanghai Ninth pessoas ’ s Hospital afiliado para Shanghai JiaoTong University School of Medicine com o protocolo número [2017] 063. 1. estabelecimento de um modelo de osteoartrite do joelho de rato Surgically-Induced …

Representative Results

A fim de induzir modelo KOA, MM realizou-se na articulação do joelho direito de ratos SD (Figura 3). Oito semanas após a cirurgia, ratos foram sacrificados e as seções série de articulações de joelho foram avaliadas com as duas H & E e safranina O/Fast Green coloração (Figura 4). Para H & E coloração, a superfície da cartilagem articular exibiu fronteiras mais ásperos nos joelhos cirurgia do que a articulaç…

Discussion

Normas de segurança e estudos de biodistribuição de terapia com células estaminais são urgentemente necessários antes de trazermos o tratamento de células-tronco regenerativa para KOA do banco ao lado do cama. No entanto, o ambiente patológico de doença desempenha um papel importante na persistência e biodistribuição de transplantado haMSCs¹⁰. Recentemente, nosso grupo demonstrou que injeção intra-articular de haMSCs mais persistentes em um ambiente de KOA patológico do que injeçõ…

Materials

Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None