В естественных условиях Отслеживание человека жировой производные мезенхимальных стволовых клеток в мышиной модели артроз колена с красителем липофильных флуоресцентных мембраны
Summary
Этот протокол описывает эффективный способ контроля за сохранение клеток и накопление жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSCs) far-red флуоресценции маркировки в мышиной модели коленного остеоартрита (КОА) через Внутрисуставных инъекций (IA).
Abstract
Чтобы поддерживать клиническое применение жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSC) терапии для коленного остеоартрита (КОА), мы изучили эффективность клеток сохранение и накопление haMSCs в животных моделях. Мы продемонстрировали метод для обозначения клеточной мембраны haMSCs с липофильных флуоресцентных красителей. Впоследствии Внутрисуставных инъекций помечены клетки крыс с хирургическим индуцированных KOA контролируется динамически в vivo imaging системы. Мы заняты липофильных carbocyanines сделал (ДППК18 (5)), far-red флуоресцентные аналоговый Dil (диалкилкарбоцианины), которые использовали красный лазер, чтобы избежать возбуждения естественный зеленый аутофлюоресценция от окружающих тканей. Кроме того красный смещается выбросов спектры допустимое глубокие ткани изображений в живых животных и маркировки процедура вызвала не цитотоксических эффектов или функциональные повреждения haMSCs. Такой подход было показано, быть методом эффективного отслеживания для haMSCs в мышиной модели KOA. Применение этого метода может также использоваться для определения оптимального управления маршрут и дозировка MSCs из других источников в доклинических исследований.
Introduction
Коленного остеоартрита (КОА) является результатом потери суставного хряща и прогрессирующим воспалением, который стал основным хронических заболеваний у пожилых людей во всем мире1дегенеративные расстройства. Однако текущий терапии с использованием противовоспалительных препаратов, физической добавки и хирургических процедур может обеспечить лишь временное облегчение для симптоматического боли2.
Жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSCs) стали многообещающим регенеративной средство для коленного остеоартрита, ввиду их Multipotent с дифференциации, потенциал для регенерации хряща и иммуномодулирующие свойства3, 4. По сравнению с фармакологическими маршрутов для изучения механизмов действий в естественных условиях, отслеживание жить haMSCs в небольших животных моделях KOA поучительно в настоящее время установить обоснование и целесообразности haMSC терапии до клинического применения. Для доклинических испытаний, медиальной meniscectomy (мм) дестабилизирует механической нагрузки совместной побудить KOA в крыс, которая обеспечивает относительно осуществимости модель с последовательной воспроизводимость5. Начала KOA индуцированных мм раньше чем передней крестообразной связки перерезка отдельно или в сочетании с частичным медиальный meniscectomy6. Таким образом долгосрочного взаимодействия между вводят haMSCs с патологическим микроокружения KOA часто оцениваются в крыс, вызванных мм7,8.
Хотя Терапевтическая эффективность haMSCs был широко сообщалось, соответствующие знания на сохранение в vivo имплантированных haMSCs через Внутрисуставных инъекций (IA) является дефицитных9,10. Таким образом были разработаны различные методы клеточной маркировки, включая immunohistology11, Люцифераза12, Зеленый флуоресцирующий белок13 трансфекции, оксид железа, маркировки для магнитно-резонансная томография (МРТ)14 и многочисленные люминесцентные клеток красители8,,1516. По сравнению с трудоемкой гистология анализы, в естественных условиях неинвазивной визуализации использует оптические устройства для обнаружения реального времени распределение и динамика клеток, помечены флуоресцентные сигналов10,17. Для функциональной живой клетки изображений, cytocompatible люминесцентные маркировки — сложные отслеживания радиоактивных бесплатно техника раскрыть клеточной деятельности после трансплантации стволовых клеток18. Кроме того многоцветный липофильных флуоресцентных красителей обладают преимуществами над амино реактивной гидрофильные красителей или флуоресцентных белков, включая их Улучшенная ячейка проницаемость и расширенной флуоресценции квантовой урожайности19.
Таким образом, здесь включены протоколы используют красный лазер для возбуждения клеток, помечены липофильных carbocyanines сделал (ДППК18(5)), который является far-red флуоресцентные Дил (диалкилкарбоцианины) аналоговый20. Красный смещается возбуждения и выбросов спектры избегает вмешательства autofluorescent и позволяет глубоко ткани изображений в течение длительного периода времени в живых животных8. Этот метод отслеживания-клеток в vivo помечены сделал действителен для мониторинга пересаженные стволовые клетки, такие как haMSCs, в моделях животных, которая необходима для понимания и улучшения текущей восстановительной терапии стволовой клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Прежде чем мы можем принести регенеративной стволовых клеток лечение для Коа из скамейке в постели срочно необходимы стандарты безопасности и накопление исследования стволовых клеток. Однако среды патологических заболеваний играет важную роль в сохранение и накопление пересаженных…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Настоящее исследование было поддержано Шанхай инновационного финансирования (1402H 294300) при поддержке науки и технологии Комиссии из Шанхая муниципалитета (CN) для Вэнь Вана. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Гуандун Чжоу (национальные ткани инженерных центр Китая) за его техническую помощь и научные рекомендации для этой рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить г-н Huitang ся (девятого Шанхая больница) за его помощь в животных.
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin, , et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
