אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע
Summary
פרוטוקול זה מתאר דרך יעילה כדי לנטר את התא התמדה ואת biodistribution של האדם נגזר שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום תיוג במודל חולדה דלקת מפרקים ניוונית (קואה) הברך באמצעות הזרקה תוך-מפרקיות (IA).
Abstract
על מנת לתמוך היישום הקליני של האדם נגזר שומן mesenchymal טיפול בתאי גזע (haMSC) עבור דלקת מפרקים ניוונית בברך (קואה), בדקנו את היעילות של תאים התמדה ואת biodistribution של haMSCs במודלים של בעלי חיים. להדגים שיטה לתייג את קרום התא של haMSCs עם lipophilic הפלורסנט. לאחר מכן, הזרקה תוך-מפרקיות של התאים עם תוויות בחולדות עם קואה בניתוח המושרה נוטרו באופן דינאמי על-ידי יישום ויוו מערכת הדמיה. אנחנו נוקטים את lipophilic carbocyanines עשה (DilC18 (5)), אנלוגי דיל (dialkylcarbocyanines) פלורסנט מרחיקת אדום, אשר מנוצל לייזר אדום כדי להימנע עירור של autofluorescence ירוק טבעי מן הרקמות הסובבות. יתר על כן, האדום-העביר ספקטרום הפליטה של מותר לדימות רקמות עמוק בבעלי חיים וההליך תיוג גרם ללא אפקטים ציטוטוקסיות או פגיעה תפקודית haMSCs. גישה זו הוכח להיות שיטה מעקב יעיל אחר עבור haMSCs במודל קואה חולדה. היישום של שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע את דרך ניהול אופטימלי ואת המינון של MSCs ממקורות אחרים במחקרים קליניים.
Introduction
דלקת מפרקים ניוונית בברך (קואה) היא הפרעה ניוונית הנובעות אובדן סחוס במפרק ודלקת מתקדמת, אשר הפך מרכזי מחלה כרונית אצל הקשישים ברחבי העולם1. עם זאת, טיפולים שוטפים באמצעות תרופות אנטי דלקתיות, תוספי הפיזי ניתוחים רק עשוי לספק הקלה זמנית לכאב סימפטומטי2.
האדם הנגזרות שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) הפכו להיות תרופה משובי מבטיח עבור דלקת מפרקים ניוונית בברך, בשל התמיינות multipotent שלהם פוטנציאל התחדשות הסחוס לבין מאפיינים immunomodulatory3, 4. לעומת מסלולים תרופתי לחקור מנגנונים של פעולה ויוו, מעקב אחר haMSCs בשידור חי במודלים חייתיים קואה קטן הוא מאלף כיום להקים את הרציונל ואת הכדאיות של טיפול haMSC לקראת יישום קליני. בדיקה פרה, meniscectomy המדיאלי (מ מ) שיערער את העומס המכני של המפרק לזירוז קואה בחולדות, המספקת מודל ריאלי יחסית עקבית הפארמצבטית5. תחילתה של KOA שנגזרות מ מ הוא מוקדם יותר חיתוך צולבת קדמית לבד או בשילוב עם meniscectomy המדיאלי חלקי6. לכן, יחסי גומלין לטווח ארוך haMSCs מוזרק עם microenvironment פתולוגית של KOA הם לעיתים קרובות העריכו בחולדות שנגזרות מ מ7,8.
למרות יעילות טיפולית של haMSCs כבר ידע רלוונטי שדווח בהרחבה על התמדתו ויוו של haMSCs מושתל באמצעות הזרקה תוך-מפרקיות (IA) הוא נדיר9,10. לפיכך, שונים הסלולר תיוג פותחו שיטות, כולל פראפין11לוציפראז12, תרביות תאים13 חלבון פלואורסצנטי ירוק, תחמוצת ברזל תיוג עבור דימות תהודה מגנטית (MRI)14 ,15,8,צבעי פלורסנט תא רבים16. אין ויוו הדמיה לא פולשנית בהשוואה היסטולוגיה מהגידולים ניתוחים, מעסיקה התקנים אופטיים כדי לזהות את התפלגות בזמן אמת ואת הדינמיקה של תאים עם תוויות עם אותות פלואורסצנט10,17. עבור הדמיה תפקודית תא חי, תיוג פלורסנט cytocompatible היא טכניקה מתוחכמת רדיואקטיבי ללא מעקב כדי לחשוף את פעילות הסלולר לאחר השתלת תא גזע18. יתר על כן, ססגוניות צבעי פלורסנט lipophilic בעלי יתרונות אמינו ונבדקים צבע הידרופילית או חלבונים פלורסנט, כולל שלהם תא משופרת חדירות פלורסצנטיות משופרת קוונטית התשואות19.
לפיכך, הפרוטוקולים כלולים כאן לנצל אדום לייזר כדי לעורר תאים המסומנת lipophilic carbocyanines עשה (DilC18(5)), וזו מרחיקת אדום פלואורסצנטי דיל (dialkylcarbocyanines) אנלוגי20. אדום-העביר עירור, פליטת הספקטרום של ימנע התערבות autofluorescent ומאפשר הדמיה על פני תקופה ארוכה של זמן חיים8רקמות עמוק. שיטה זו של מעקב אחר תאים ויוו המסומנת האם חוקי עבור ניטור המושתלים תאי גזע, כגון haMSCs, במודלים של בעלי חיים, שהוא חיוני להבין ולשפר את הטיפול משובי הנוכחי של תאי גזע.
Protocol
Representative Results
Discussion
תקני בטיחות ולימודים biodistribution של טיפול בתאי גזע נחוצים בדחיפות לפני שנוכל להביא משובי בתאי גזע לטיפול קואה מהספסל אל המיטה. עם זאת, הסביבה פתולוגי של המחלה ממלא תפקיד חשוב התמדה ו biodistribution של המושתלים haMSCs10. לאחרונה, הקבוצה שלנו הוכיח כי הזרקה תוך-מפרקיות של haMSCs שהתמידו עוד בסבי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר הנוכחי נתמכה על ידי שנגחאי חדשנות מימון (1402H 294300) בחסות המדע, הטכנולוגיה עמלה של שנגחאי העירייה (CN) כדי ד ר ון וונג. ברצוננו להודות ד ר גואנג-דונג ג’ואו (הלאומי רקמות הנדסה מרכז של סין) שלו סיוע וייעוץ טכני מדעי עבור כתב יד זה. אנחנו רוצה גם להודות מר Huitang שיה (החולים שנגחאי התשיעית לאנשים בבית) על עזרתו רווחת בעלי חיים.
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin, , et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
