In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana
Summary
Questo protocollo descrive un modo efficiente per monitorare la persistenza delle cellule e la biodistribuzione di adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) di fluorescenza da’ etichettatura in un modello di osteoartrite (KOA) del ginocchio di ratto tramite iniezione intra-articolare (IA).
Abstract
Per supportare l’applicazione clinica della terapia umana adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali (haMSC) per l’osteoartrite del ginocchio (KOA), abbiamo esaminato l’efficacia di persistenza delle cellule e biodistribuzione di haMSCs nei modelli animali. Abbiamo dimostrato un metodo per assegnare un’etichetta della membrana cellulare di haMSCs con colorante fluorescente lipofilico. Successivamente, iniezione intra-articolare delle cellule con etichettate in ratti con KOA chirurgicamente indotta è stata monitorata in modo dinamico da un in vivo imaging system. Abbiamo impiegato il lipofilico carbocyanines fatto (DilC18 (5)), un analogo fluorescente da’ di Dil (dialkylcarbocyanines), che utilizzato un laser rosso per evitare l’eccitazione del autofluorescence verde naturale dai tessuti circostanti. Inoltre, lo spettro di emissione rosso-spostato di permesso deep tissue imaging negli animali vivi e la procedura di etichettatura non causato nessun effetti citotossici o danno funzionale a haMSCs. Questo approccio ha dimostrato di essere un metodo di verifica efficiente per haMSCs in un modello di ratto KOA. L’applicazione di questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per determinare la via di somministrazione ottimale ed il dosaggio delle MSC da altre fonti in studi pre-clinici.
Introduction
Osteoartrite del ginocchio (KOA) è un disordine degenerante derivanti dalla perdita di cartilagine articolare e l’infiammazione progressiva, che è diventata una malattia cronica importante negli anziani intorno al mondo1. Tuttavia, le attuali terapie con farmaci anti-infiammatori, integratori fisici e procedure chirurgiche possono fornire solo un sollievo temporaneo per dolore sintomatico2.
Adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) sono diventati un rimedio rigenerativo promettente per l’osteoartrite del ginocchio, a causa della loro differenziazione multipotenti potenziale per la rigenerazione della cartilagine e immunomodulatori proprietà3, 4. Rispetto ai percorsi farmacologici per studiare i meccanismi di azione in vivo, tracking live haMSCs in modelli animali di piccole dimensioni KOA è attualmente istruttivo per stabilire la spiegazione razionale per e la fattibilità della terapia haMSC prima applicazione clinica. Per i test preclinici, meniscectomia mediale (MM) destabilizza il carico meccanico del giunto per indurre KOA in ratti, che fornisce un modello relativamente fattibile con riproducibilità costante5. L’insorgenza di KOA indotta da MM è antecedente il transection del legamento crociato anteriore da solo o combinato con parziale meniscectomia mediale6. Pertanto, le interazioni a lungo termine tra haMSCs iniettato con il microambiente patologico di KOA sono spesso valutate in ratti indotti da MM7,8.
Anche se l’efficacia terapeutica di haMSCs è stato ampiamente riferita, pertinenti conoscenze sulla persistenza in vivo di haMSCs impiantato tramite iniezione intra-articolare (IA) è scarsa9,10. Quindi, sono stati sviluppati vari metodi di etichettatura cellulare, tra cui immunohistology11, luciferasi12, trasfezione13 proteina fluorescente verde, ossido di ferro di etichettatura per imaging a risonanza magnetica (MRI)14 e numerose cellule fluorescenti coloranti8,15,16. Confrontato con analisi di istologia laborioso, in vivo imaging non-invasivo si avvale di dispositivi ottici per rilevare la distribuzione in tempo reale e dinamica delle cellule identificate con segnali fluorescenti10,17. Per l’imaging funzionale di cellule vive, citocompatibili Contrassegno fluorescente è una tecnica di sofisticato monitoraggio radioattivo senza rivelare attività cellulari dopo trapianto di cellule staminali18. Inoltre, multicolore tinture fluorescenti lipofili possiedono vantaggi rispetto ai coloranti idrofiliche ammino-reattivi o proteine fluorescenti, compresi i loro permeabilità cellulare migliorata e rafforzata fluorescenza quantistica rendimenti19.
Così, i protocolli inclusi qui utilizzano un rosso laser per eccitare le cellule identificate con lipofilico carbocyanines fatto (DilC18(5)), che è un da’ fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analogico20. Gli spettri rosso-spostato di eccitazione e di emissione di evita interferenze autofluorescent e permette deep tissue imaging per un lungo periodo di tempo in animali vivi8. Questo metodo di rilevamento delle cellule in vivo etichettato con fatto è valido per il monitoraggio cellule staminali trapiantate, come haMSCs, in modelli animali, che è essenziale per capire e migliorare l’attuale terapia rigenerativa con cellule staminali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Norme di sicurezza e studi di biodistribuzione di terapia della cellula formativa sono urgentemente necessari prima che possiamo portare il trattamento rigenerativo delle cellule staminali per KOA dalla panchina al capezzale. Tuttavia, l’ambiente patologico della malattia svolge un ruolo importante nella persistenza e biodistribuzione di trapiantati haMSCs10. Recentemente, il nostro gruppo ha dimostrato che iniezione intrarticolare di haMSCs più persistenti in un ambiente di KOA patologico quanto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da Shanghai finanziamento dell’innovazione (1402H 294300) sponsorizzato dalla scienza e dalla tecnologia Commissione di Shanghai comune (CN) al Dr. Wen Wang. Vorremmo ringraziare il Dr. Guangdong Zhou (nazionale Tissue Engineering Center di Cina) per la sua assistenza tecnica e consulenza scientifica per questo manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il signor Huitang Xia (ospedale del popolo di Shanghai nona) per il suo aiuto nel benessere degli animali.
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
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