DNA farvning metode baseret på formazankoncentrationen nedbør induceret af blå lys eksponering
Summary
Denne metode giver selektiv farvning og kvantificering af DNA i geler af iblødsætning gel i en SYBR Green jeg / Nitro blå Tetrazolium løsning og derefter udsætter det for sollys eller en blå lyskilde. Dette frembringer en synlig bundfald og kræver næsten ingen udstyr, hvilket gør den ideel til feltet brug.
Abstract
DNA farvning metoder er meget vigtige for biomedicinsk forskning. Vi har udviklet en simpel metode, der giver mulighed for DNA visualisering med det blotte øje ved dannelsen af en farvede bundfald. Det virker ved iblødsætning af acrylamid eller Agarosen DNA gel i en opløsning af 1 x (svarende til 2,0 µM) SYBR Green jeg (SG jeg) og 0,20 mM nitro blå tetrazolium, der producerer en lilla bundfald af formazankoncentrationen når de udsættes for sollys eller specifikt blåt lys. Også, DNA opsving tests blev udført ved hjælp af en ampicillin resistente plasmid i en agarosegel farves med vores metode. Et større antal kolonier blev opnået med vores metode end med traditionelle farvning bruge SG jeg med ultraviolet belysning. Den beskrevne metode er hurtig, specifik og ugiftigt for DNA påvisning, tillade visualisering af biomolekyler til “blotte øje” uden en transilluminator, og er billig og passende for feltet brug. Af disse grunde har vores nye DNA farvning metode potentielle fordele for både forskning og industri.
Introduction
Med fremskridt inden for biokemi og molekylær biologi, har de undersøgelser, der involverer DNA kræves bedre teknikker til at analysere DNA. Den første metode til DNA farvning var sølvfarvning, som er meget følsomme, men mangler selektivitet og tillader ikke prøve opsving. Udviklingen af fluorescerende DNA farvning tillod senere, selektiv kvantificering af DNA med mulighed for prøve opsving. En af de første fluorescerende farvestoffer anvendes til DNA kvantificering var ethidium bromid1, som er mutagent2. Men nu der er forbedret fluorescerende farvestoffer, der er sikrere og mere følsom, såsom GelRed og SYBR Green jeg (SG jeg)3; men alle disse fluorescerende farvestoffer kræver brug af en ultraviolet (UV) transilluminator eller fluorimeter.
Der er andre teknikker for synligt farvning DNA, såsom methylene blå4 og krystalviolet5,6,7,8,9, men alle disse lider af nedsat følsomhed og selektivitet. Tetrazolium salte er organiske forbindelser modtagelige for reduktion, og når dette sker de danner et uopløseligt og farvede formazankoncentrationen bundfald10,11. For nylig, nogle bivalent tetrazolium salte har vist sig at binde til DNA på grund af deres positive tetrazolium ringe12.
I en nylig publikation13foreslog en ny synlig teknik til at pletten og kvantificere DNA i polyacrylamidgeler, ved hjælp af reduktion af en bivalent tetrazolium salt kaldet nitro blå tetrazolium (NBT) og fluorescerende farvestoffer som ethidiumbromid, GelRed, SYBR Green jeg og SYBR guld. Denne reaktion arbejdede blåt lys eller sollys og tilladt prøve opsving med forbedret kvalitet sammenlignet med brugen af GS jeg med en UV transilluminator. Formålet med dette papir er at give en detaljeret protokol af farvning teknik bruger tetrazolium salte.
Protocol
Representative Results
Discussion
En følsom og roman DNA farvning metode baseret på reduktion af NBT og brugen af SG jeg blev præsenteret i denne artikel. Den kritiske trin i denne protokol er inkubationstiden gel i NBT-SG jeg løsning og koncentrationen af NBT. Agarosegelitris farvning tid er længere end for acrylamid geler på grund af den større tykkelse af agarosegelitris. Denne metode fungerer ikke godt i overværelse af SDS, som NBT udfældes i kontakt med det. Hvis gelen opnår en lilla baggrund, anbefales det, at en anden gel forberedes og a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, projekt 11130263 (til CW), projekt CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (til CW) og U-inicia fra Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (til CW).
Tak til Tatiana Naranjo-Palma for hjælpen i den indledende fase af dette projekt, Dr. Jorge Babul og Diego Quiroga-Roger for nyttig diskussion, Robert Lesch for revision af manuskript og Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas fra Universidad de Chile. Tak for at Marcelo Pérez til redigering af video og Neil Stevens til at korrigere tekst og Errol Watson for at give voice-over.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
