Método basado en la precipitación de formazán inducida por exposición a la luz azul de la tinción de ADN
Summary
Este método permite la coloración selectiva y cuantificación de DNA en geles sumergiendo el gel en un SYBR Green I / solución Nitro azul de tetrazolio y luego exponerlo a la luz del sol o una fuente de luz azul. Esto produce un precipitado visible y no requiere casi ningún equipo, haciéndolo ideal para uso de campo.
Abstract
Métodos de tinción de ADN son muy importantes para la investigación biomédica. Hemos diseñado un método sencillo que permite la visualización de ADN a simple vista por la formación de un precipitado coloreado. Actúa empapando la acrilamida o agarosa ADN del gel en una solución de 1 x (equivalente a 2.0 μm) SYBR Green I (SG I) y 0,20 mM nitro blue tetrazolium que produce una púrpura precipitar de precipitado cuando se expone a la luz solar o específicamente la luz azul. También, se realizaron pruebas de recuperación de ADN usando un plásmido resistente a ampicilina en un gel de agarosa teñido con nuestro método. Se obtuvo un mayor número de colonias con nuestro método que tradicional que manchaba usando SG con iluminación ULTRAVIOLETA. El método descrito es rápido, específico y no tóxico para la detección de ADN, permitiendo visualización de biomoléculas a “simple vista” sin un transiluminador y es barato y apropiado para el uso del campo. Por estas razones, nuestro ADN nueva tinción tiene beneficios potenciales para la investigación y la industria.
Introduction
Con los avances en Bioquímica y biología molecular, los estudios de ADN han exigido mejores técnicas para analizar el ADN. El primer método para la tinción de ADN fue plata coloración, que es muy sensible, pero carece de selectividad y no permite recuperación de muestra. Más tarde, el desarrollo de la tinción fluorescente del ADN permitió la cuantificación selectiva de DNA con la posibilidad de recuperación de la muestra. Uno de los primeros tintes fluorescentes utilizados para la cuantificación de ADN fue de bromuro de etidio1, que es mutagénico2. Sin embargo, ahora hay mejores tintes fluorescentes que son más seguros y más sensibles, como GelRed y SYBR Green I (SG I)3; pero todos estos tintes fluorescentes requieren el uso de un transiluminador (UV) ULTRAVIOLETA o un Fluorímetro.
Existen otras técnicas de tinción visiblemente ADN, tales como azul de metileno4 y cristal violeta5,6,7,8,9, pero todos ellos sufren de disminución de la sensibilidad y selectividad. Las sales de tetrazolio son susceptibles a la reducción de compuestos orgánicos y cuando esto sucede forman un insoluble y formazan coloreado precipitado10,11. Recientemente, algunas sales de tetrazolio bivalente se han demostrado para atar al ADN debido a sus anillos de tetrazolio positivo12.
En una reciente publicación13, se propuso una nueva técnica visible mancha y cuantificar ADN en geles de poliacrilamida, mediante la reducción de una sal de tetrazolio bivalente se llama nitro azul tetrazolio (NBT) y tintes fluorescentes como el bromuro de etidio, GelRed, SYBR Green I y SYBR oro. Esta reacción trabaja en presencia de luz azul o luz del sol y permite la recuperación de la muestra con la mejora de la calidad en comparación con el uso de SG I con un transiluminador UV. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado de la técnica de tinción con tetrazolio sales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una sensible y novela tinción de ADN basado en la reducción de NBT y el uso de SG me presenté en este artículo. El paso crítico en este protocolo es el tiempo de incubación del gel en el NBT-SG solución y la concentración de NBT. El tiempo de tinción de geles de agarosa es más largo que para geles de acrilamida debido al mayor espesor de geles de agarosa. Este método no funciona bien en presencia de SDS como NBT precipita en contacto con ella. Si el gel obtiene un fondo púrpura, recomendamos que se prepare ot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, proyecto 11130263 (a la derecha), proyecto CONICYT, NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (a la derecha) y U-inicia de la Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (a la derecha).
Gracias a Tatiana Naranjo-Palma por la ayuda en la etapa inicial de este proyecto, el Dr. Jorge Babul y Diego Quiroga-Roger de discusión útil, Robert Lesch para revisar el manuscrito y la Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Sociedad de la Universidad de Chile. Gracias también a Marcelo Pérez para editar el video y Neil Stevens para corregir el texto y Errol Watson para proporcionar la voz en OFF.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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