DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen
Summary
Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.
Abstract
DNA-Färbung Methoden sind sehr wichtig für die biomedizinische Forschung. Wir haben eine einfache Methode, die DNA-Visualisierung mit dem bloßen Auge durch die Bildung von farbigen Niederschlag ermöglicht entwickelt. Es funktioniert durch Einweichen der Acrylamid oder DNA Agarose-gel in einer Lösung aus 1 X (entspricht 2,0 µM) SYBR Green ich (SG ich) und 0,20 mM Nitro blau Tetrazoliumsalz, die eine lila produziert Niederschlag von Formazan bei Sonneneinstrahlung oder speziell blaues Licht. Auch wurden DNA-Recovery Tests durchgeführt mit einem Ampicillin resistent Plasmid in einem Agarosegel mit unserer Methode befleckt. Eine größere Zahl von Kolonien wurde erreicht mit unserer Methode als mit traditionellen Färbung mit SG ich mit UV-Beleuchtung. Das beschriebene Verfahren ist schnell, spezifisch und nicht toxisch für DNA-Nachweis, so dass Visualisierung von Biomolekülen mit dem “bloßen Auge” ohne ein Transilluminator und ist billig und für den mobilen Einsatz geeignet. Aus diesen Gründen hat unsere neue DNA Färbung Methode potenzielle Nutzen für Forschung und Industrie.
Introduction
Mit den Fortschritten in der Biochemie und Molekularbiologie haben die Studien mit DNA bessere Techniken zur DNA Analyse erforderlich. Die erste Methode für DNA-Färbung wurde Silber Färbung, die sehr empfindlich ist, aber ermangelt Selektivität und erlaubt keine Probenrückgewinnung. Später, erlaubt die Entwicklung von fluoreszierenden DNA-Färbung die selektive Quantifizierung der DNA mit der Möglichkeit der Probenrückgewinnung. Eines der ersten Fluoreszenzfarbstoffen verwendet für DNA-Quantifizierung war Interkalation Bromid1, mutagene2. Allerdings gibt es nun verbesserte fluoreszierende Farbstoffe, die sicherer und empfindlicher, wie GelRed und SYBR Green sind ich (SG ich)3; aber alle diese Leuchtstofffärbungen erfordern den Einsatz eines ultravioletten (UV) Transilluminator oder Fluorimeter.
Es gibt andere Techniken zum Färben sichtbar DNA, wie Methylenblau4 und Kristallviolett5,6,7,8,9, aber all diese Leiden verringerte Empfindlichkeit und Selektivität. Die Tetrazolium-Salze sind organische Verbindungen, die anfällig für Reduktion, und in diesem Fall bilden sie eine unlösliche und farbigen Formazan überstürzen sich10,11. Vor kurzem zeigten einige bivalenten Tetrazoliumsalz Salze aufgrund ihrer positiven Tetrazoliumsalz Ringe12an DNA zu binden.
In den letzten Veröffentlichung13wurde eine neue sichtbare Technik zu färben und zu quantifizieren DNA in Polyacrylamid-Gele vorgeschlagen, mit der Reduktion von bivalenten Tetrazoliumsalz Salz namens Nitro blau Tetrazoliumsalz (NBT) und Fluoreszenz-Farbstoffen wie Interkalation Bromid, GelRed, SYBR Green I und SYBR Gold. Diese Reaktion bei Anwesenheit von blauem Licht oder Sonnenlicht gearbeitet und erlaubt Probenrückgewinnung mit verbesserter Qualität gegenüber dem Einsatz von SG ich mit einem UV-Transilluminator. Das Ziel dieses Papiers ist ein detailliertes Protokoll der Färbung Technik mit Tetrazoliumsalz bieten Salze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine sensible und Roman DNA Färbung Methode anhand der Reduzierung der NBT und die Verwendung von SG, die ich in diesem Artikel vorgestellt wurde. Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll ist die Inkubationszeit des Gels in der NBT-SG ich Lösung und die Konzentration der NBT. Die Färbung Agarose-Gele dauert länger als bei Acrylamid Gele wegen der größeren Dicke Agarose-Gele. Diese Methode funktioniert nicht gut im Beisein von SDS, wie NBT mit ihm in Berührung ausfällt. Wenn das Gel einen violetten Hintergrun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von Fondo Nacional de Desarrollo y Científico Tecnológico (Fondecyt), Chile, Projekt 11130263 (für CW), Projekt CONICYT ++ NERC Programa de Überwachung Internacional PCI-PII20150073 (für CW) und U-Inicia aus der Vicerrectoría-de Investigación Universidad de Chile (CW).
Danke an Tatiana Naranjo-Palma für die Hilfe in der Anfangsphase des Projekts, Dr. Jorge Babul und Diego Quiroga-Roger für hilfreiche Diskussion, Robert Lesch für die Überarbeitung des Manuskripts und Dirección de Extensión De La spielte de Ciencias Químicas y Farmacéuticas von Universidad de Chile. Vielen Dank auch an Marcelo Pérez für die Videobearbeitung und Neil Stevens zum Korrigieren von Text und Errol Watson für die Bereitstellung von der Voice-over.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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