DNA Formazan yağış mavi ışığa maruz tarafından indüklenen esas alarak yöntemini boyama
Summary
Bu yöntem bir SYBR yeşil jel ıslatarak seçici boyama ve jelleri içinde DNA’ın miktar sağlar ben / Nitro mavi Tetrazolium çözüm ve sonra güneş ışığı ya da mavi bir ışık kaynağına maruz. Bu işlem görünür bir çökelti oluşturur ve alan kullanımı için ideal hale neredeyse hiçbir ekipman.
Abstract
DNA boyama yöntemleri Biyomedikal Araştırma için çok önemlidir. Biz DNA görselleştirme çıplak gözle renkli bir çökelti oluşumunu sağlayan basit bir yöntem tasarlanmıştır. Akrilamid ıslatarak çalışır veya özel DNA SYBR yeşil 1 x (2.0 µM için eşdeğer) bir çözümde jel ben (SG ben) ve bir mor üretir 0.20 mM nitro mavi tetrazolium güneş ışığına maruz formazan, çökelti veya özellikle mavi ışık. Ayrıca, DNA kurtarma testleri bizim yöntemi ile lekeli bir özel jel Ampisilin dayanıklı bir plazmid kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Koloniler daha çok sayıda geleneksel ile bizim yöntemiyle elde edildi SG kullanarak boyama ben ultraviyole aydınlatmalı. Açıklanan yöntemi hızlı, belirli ve biomolecules bir transilluminator olmadan “çıplak gözle” görselleştirme izin DNA tespiti için toksik olmayan ve ucuz ve alan kullanımına uygun. Bu nedenlerden dolayı bizim yeni DNA’ları boyama yöntemi araştırma ve sanayi için potansiyel yararları vardır.
Introduction
Biyokimya ve moleküler biyoloji geliştirmelerle DNA’yla çalışmaları daha iyi teknikleri DNA analiz etmek için gerekli. DNA boyama için belgili tanımlık ilk yöntem gümüş boyama, hangi çok hassas ama yoksun seçicilik ve örnek kurtarma izin vermez. Daha sonra floresan DNA boyama geliştirme örnek kurtarma imkanı ile DNA’ın miktar seçici izin. DNA miktar için kullanılan ilk floresan boyalar etidyum bromür1, mutajenik2olan biriydi. Ancak, şimdi orada daha güvenli ve daha hassas, GelRed ve SYBR yeşil gibi geliştirilmiş floresan boyalar ben (SG ben)3; Ama bütün bu floresan boyalar bir ultraviyole (UV) transilluminator veya fluorimeter kullanımı gerektirir.
DNA, metilen mavisi4 ve kristal violet5,6,7,8,9gibi gözle görülür boyama diğer tekniği vardır, ama tüm-in bunlar azaltılmış hassasiyeti muzdarip ve seçicilik. Tetrazolium tuzları organik bileşikler azaltılması için duyarlı ve bu durumda onlar çözünmez bir formu ve renkli formazan çökelti10,11. Son zamanlarda, bazı bivalent tetrazolium tuzları için DNA nedeniyle onların olumlu tetrazolium halkaları12bağlamak için gösterilmiştir.
Bir son yayın13‘ te, nitro mavi tetrazolium (NBT) ve floresan boyalar gibi etidyum bromür, GelRed denilen bir bivalent tetrazolium tuz azaltma kullanarak leke ve DNA polyacrylamide jeller ölçmek için yeni bir görünür teknik önerilmiş, SYBR yeşil ben ve SYBR altın. Mavi ışık veya güneş ışığı huzurunda çalıştı ve kalite ile örnek kurtarma izin bu reaksiyon ben ile UV transilluminator SG kullanımına kıyasla. Bu kağıt tetrazolium boyama tekniği detaylı bir protokol sağlar tuzlar hedefidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Duyarlı ve roman yöntemi boyama DNA NBT azalma ve bu makalede sunulan SG kullanımı temel. Bu iletişim kuralı için kritik adım jel NBT-SG kuluçka zamanı ben çözüm ve NBT konsantrasyonu. Boyama için özel jelleri özel jelleri büyük kalınlığı nedeniyle Akrilamid tırnaklar için jeller daha uzun zamanı. NBT bu temas precipitates gibi bu yöntem de SDS huzurunda çalışmıyor. Jel mor bir arka plan alırsa, biz başka bir jel hazırlıklı olmak tavsiye ve ışık pozlama süresini azaltmak için. Eğe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser desteklenen Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Şili, (CW için) proje 11130263, proje CONICYT + NERC + Programa de tarafından Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (için CW) ve U-inicia: Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (CW için).
Tatiana Naranjo-Palma için Ciencias Químicas y Dr. Jorge Babul ve Diego Quiroga-Roger yararlı tartışma, el yazması ve Dirección de extensión de la Facultad de gözden geçirilmesi için Robert Lesch için bu projenin ilk aşaması yardım için teşekkür Universidad de Chile üzerinden Farmacéuticas. Marcelo video düzenleme için Pérez ve Neil Stevens ses sağlamak için metin ve Errol Watson düzeltmek için çok teşekkür ederiz.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
