ДНК, окрашивание метод, основанный на Формазаны осадков, вызванных синий освещенности
Summary
Этот метод позволяет селективного окрашивания и количественного определения ДНК в гелях путем замачивания геля в зеленом SYBR я / нитро синий Tetrazolium решения и затем подвергая его солнечного света или синий источник света. Это создает видимый преципитат и почти не требует оборудования, что делает его идеальным для использования на местах.
Abstract
ДНК пятная методы очень важны для биомедицинских исследований. Мы разработали простой метод, который позволяет визуализировать ДНК невооруженным глазом формирование цветные преципитат. Она работает путем замачивания акриламида или агарозы дна гель в растворе 1 x (эквивалент 2,0 мкм) SYBR зеленый я (SG я) и 0,20 мм нитро синий tetrazolium, которая производит фиолетовый осадка из Формазаны при воздействии солнечного света или специально синий свет. Кроме того восстановление ДНК были проведены с использованием ампициллина устойчивостью плазмида в агарозном геле, окрашенных с нашим методом. Большее количество колоний был получен с нашим методом чем с традиционными окрашивание с помощью SG я с ультрафиолетовым освещением. Описан метод быстро, конкретные и нетоксичные для обнаружения ДНК, позволяя визуализации биомолекул «невооруженным глазом» без transilluminator и недорогой и подходит для использования в полевых. По этим причинам наши новые ДНК, окрашивание метод имеет потенциальные выгоды для научных исследований и промышленности.
Introduction
С достижениями в биохимии и молекулярной биологии исследования, с участием ДНК требуют более совершенных методов для анализа ДНК. Первый метод для окрашивания ДНК был серебряный пятнать, который очень чувствителен, но не хватает избирательности и не позволяют пример восстановления. Позже развитие флуоресцентные окрашивание ДНК допускается селективный количественного определения ДНК с возможностью восстановления образца. Одним из первых флуоресцентных красителей, используемых для количественного определения ДНК был бромид ethidium1, который является мутагенным2. Однако, теперь есть улучшение флуоресцентных красителей, которые являются более безопасным и более чувствительными, такие как GelRed и SYBR зеленый я (SG я)3; но все эти флуоресцентных красителей требуют использования ультрафиолетового (УФ) transilluminator или fluorimeter.
Существуют другие методы для пятнать заметно ДНК, например4 Метиленовый синий и фиолетовый кристалл5,6,,78,9, но все они страдают от пониженную чувствительность и избирательность. Tetrazolium соли органических соединений восприимчивы к сокращению и когда это происходит, они образуют нерастворимые и цветные Формазаны осадок10,11. Недавно было показано некоторые соли двухвалентной tetrazolium связываются с ДНК из-за их позитивные tetrazolium кольца12.
В недавней публикации13была предложена новая техника видимых пятен и количественного анализа ДНК в полиакриламидных гелей, используя сокращение соли двухвалентной tetrazolium под названием nitro синий tetrazolium (NBT) и флуоресцентных красителей как бромид ethidium, GelRed, SYBR зеленый, я и SYBR золото. Эта реакция работал в присутствии синий свет или солнечного света и позволило пример восстановления с улучшенным качеством по сравнению с использованием SG я с УФ transilluminator. Цель настоящего документа – представить подробный протокол окрашивание техники с использованием tetrazolium солей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чувствительных и Роман окрашивания методом ДНК на основе сокращения НБТ и использование SG, в этой статье был представлен. Важным шагом в этом протоколе это время инкубации геля в НБТ-SG я решение и концентрация НБТ. Время окрашивания гелей агарозы дольше акриламида гели из-за большей тол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана парке Fondo Nacional de Desarrollo Científico y (НФНТИ), Чили, проект 11130263 (для CW), проекта НКНТИ + НКРЭ Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (для CW) и U-inicia от Vicerrectoría де Инвестигасьон Универсидад де Чили (по часовой стрелке).
Спасибо Татьяна Наранхо-Пальма за помощь на начальном этапе этого проекта, д-р Хорхе Babul и Диего Кирога-Роджер для полезной дискуссии, Роберт Lesch для пересмотра рукопись и Dirección de extensión de la факультет de Ciencias по y Farmacéuticas от Универсидад де Чили. Спасибо слишком Марсело Перес для редактирования видео и Нил Стивенс для исправления текста и Эррол Уотсон для предоставления голос за кадром.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
