DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法
Summary
このメソッドにより、選択的染色とゲルの DNA の定量化 SYBR グリーンでゲルを浸す私/ニトロ ブルー テトラゾリウム ソリューションと、日光や青い光源にそれを公開します。これは表示の沈殿物を生成する、フィールドでの使用に最適の機器はほぼ不要します。
Abstract
DNA 染色法、生物医学研究のため非常に重要です。色の沈殿物の形成によって肉眼に目に DNA の可視化を可能にする簡単な方法を考案しました。それは、アクリルアミドを浸漬、または agarose DNA ゲル 1 x (2.0 μ M に相当) の溶液に SYBR グリーン私 (SG 私) と紫色を作り出す 0.20 mM ニトロ ブルー テトラゾリウム塩日光に露出されたときの沈殿または具体的に青色のライト。また、提案手法を用いた染色 agarose のゲルにアンピシリン耐性プラスミドを用いた DNA 回復試験を行った。コロニーの大きい数はより伝統的な手法で得られた SG を使用して染色私は紫外光照射。説明メソッドは高速、特定、および、transilluminator なし「肉眼で見える」生体分子の可視化をできるように DNA 検出のための非毒性を安価でフィールドでの使用に適した。これらの理由から、私たちの新しい DNA 染色法の研究と業界の両方に潜在的な利点があります。
Introduction
生物化学および分子生物学の発展に伴い、DNA を含む研究は DNA を分析する優れたテクニックが必要。DNA 染色する最初の方法は銀染色、非常に敏感であるが、欠けている選択性および回収はできません。その後、DNA を蛍光染色の開発許可サンプル回復の可能性のある DNA の選択的定量です。DNA の定量化に使用される最初の蛍光染料の一つは、変異2エチジウム ブロマイド1、だった。しかし、今は、安全 GelRed、SYBR グリーンなどの機密性の高い蛍光染料類の改善私 (SG 私)3;しかし、すべてこれらの蛍光染料の紫外線 (UV) transilluminator または蛍光を使用する必要があります。
4メチレン ブルーとクリスタル バイオレット5,6,7,8,9, など目に見えて、DNA を染色する方法がありますが、これらのすべてに苦しむに対する感度を下げると選択性。テトラゾリウム塩有機化合物減少に影響を受け、この場合彼らは不溶性を形成し、色塩沈殿10,11。最近では、DNA の正テトラゾリウム リング12のためにバインドするいくつかの二価テトラゾリウム塩を示されています。
最近文書13を汚し、ポリアクリルアミドゲルの DNA の定量化手法を表示する方法を提案、ニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) と GelRed、臭化エチジウムなど蛍光色素と呼ばれる二価テトラゾリウム塩の還元SYBR グリーン私とサイバー金。青色のライトや日光の存在下で勤務し、品質向上と回収を許可この反応と比較して SG の使用に私 UV transilluminator。本稿の目的は、テトラゾリウムを用いた染色技術の詳細なプロトコルを提供する塩です。
Protocol
Representative Results
Discussion
感受性と小説 DNA 染色法は NBT が減少し、私はこの記事で紹介した SG の使用に基づいています。このプロトコルの重要なステップは、NBT SG でゲルのインキュベーション時間私ソリューションおよび NBT の濃度。Agarose のゲルのより大きい厚さのために agarose のゲルの染色時間はアクリルアミドゲルよりも長くなります。このメソッド、NBT が接触して析出物も SDS 存在下で働きません。ゲルは、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フォンド ナシオナル デ開発 Científico y Tecnológico (Fondecyt)、チリ、(CW) にプロジェクト 11130263、プロジェクト チリ + NERC エイトによって支えられた (CW) に Colaboración インターナショナル PCI PII20150073 と U-inicia Vicerrectoría デから危惧デチリ (CW) します。
芸術 Químicas y 博士ホルヘ バーブルと参考については、原稿やリオイバニェス デ extensión デ ラ Facultad デ改正ロバート ・ レッシュ サンディエゴ キロガ ロジャー、このプロジェクトの初期の段階で助けタチアナ ナランホ パルマ行きのおかげでください。チリ大学から Farmacéuticas。ビデオを編集するためのマルセロ ・ ペレスとニール · スティーブンスのナレーションを提供するテキストとエロール ・ ワトソンを修正するためにあまりにも感謝します。
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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