डीएनए धुंधला Formazan नीले प्रकाश जोखिम से प्रेरित वर्षण पर आधारित विधि
Summary
इस विधि चयनात्मक धुंधला और एक SYBR ग्रीन मैं/नाइट्रो ब्लू Tetrazolium समाधान में जेल भिगोने और फिर सूरज की रोशनी या एक नीली बत्ती स्रोत को उजागर द्वारा जैल में डीएनए के ठहराव की अनुमति देता है । यह एक दृश्य हाला पैदा करता है और लगभग कोई उपकरण की आवश्यकता है, यह क्षेत्र के उपयोग के लिए आदर्श बना ।
Abstract
डीएनए धुंधला तरीके जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं । हम एक सरल तरीका है कि एक रंगीन वेग के गठन से नग्न आंखों को डीएनए दृश्य की अनुमति देता है बनाया है । यह 1x के एक समाधान में acrylamide या agarose डीएनए जेल भिगोने के द्वारा काम करता है (२.० µ एम के बराबर) SYBR ग्रीन मैं (एसजी मैं) और ०.२० mM नाइट्रो ब्लू tetrazolium है कि जब सूरज की रोशनी या विशेष रूप से नीले प्रकाश को उजागर formazan की एक बैंगनी वेग का उत्पादन । इसके अलावा, डीएनए वसूली परीक्षण एक agarose हमारे विधि के साथ सना हुआ जेल में एक एम्पीसिलीन प्रतिरोधी प्लाज्मिड का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । कालोनियों की एक बड़ी संख्या पारंपरिक के साथ की तुलना में हमारे विधि के साथ प्राप्त की थी एसजी मैं पराबैंगनी रोशनी के साथ प्रयोग दाग । वर्णित विधि तेजी से, विशिष्ट है, और गैर डीएनए का पता लगाने के लिए विषैले, एक transilluminator के बिना “नग्न आंख” के लिए, और सस्ती और क्षेत्र के उपयोग के लिए उपयुक्त है । इन कारणों के लिए, हमारे नए डीएनए धुंधला विधि दोनों अनुसंधान और उद्योग के लिए संभावित लाभ है ।
Introduction
जैव रसायन और आण्विक जीवविज्ञान में अग्रिमों के साथ, डीएनए को शामिल अध्ययन बेहतर तकनीक की आवश्यकता के लिए डीएनए का विश्लेषण किया है । डीएनए दाग के लिए पहली विधि चांदी धुंधला था, जो बहुत संवेदनशील है, लेकिन selectivity का अभाव है और नमूना वसूली की अनुमति नहीं है । बाद में, फ्लोरोसेंट डीएनए धुंधला के विकास नमूना वसूली की संभावना के साथ डीएनए के चयनात्मक ठहराव की अनुमति दी । डीएनए ठहराव के लिए इस्तेमाल किया पहले फ्लोरोसेंट रंजक में से एक ethidium ब्रोमाइड1है, जो mutagenic2है । हालांकि, अब ऐसे GelRed और SYBR ग्रीन मैं (एसजी मैं)3के रूप में, सुरक्षित और अधिक संवेदनशील हैं कि फ्लोरोसेंट रंजक में सुधार कर रहे हैं; लेकिन इन फ्लोरोसेंट रंजक के सभी एक पराबैंगनी (यूवी) transilluminator या fluorimeter के उपयोग की आवश्यकता होती है ।
वहां दिख धुंधला डीएनए के लिए अंय तकनीकों रहे हैं, जैसे methylene ब्लू4 और क्रिस्टल वायलेट5,6,7,8,9, लेकिन इन सभी को कम संवेदनशीलता से ग्रस्त है और selectivity. tetrazolium लवण कार्बनिक यौगिकों में कमी करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, और जब यह होता है वे एक अघुलनशील और रंगीन formazan के रूप में10,11हाला । हाल ही में कुछ bivalent tetrazolium साल्ट को उनके पॉजिटिव tetrazolium रिंग्स के कारण डीएनए को बाइंड करते हुए12दिखाया गया है ।
हाल ही में एक प्रकाशन में13, polyacrylamide जैल में दाग और मात्रा में डीएनए के लिए एक नया दिखाई तकनीक का प्रस्ताव किया गया था, एक bivalent tetrazolium नमक की कमी का उपयोग कर नाइट्रो ब्लू tetrazolium (एनबीटी) और ethidium ब्रोमाइड, GelRed जैसे फ्लोरोसेंट रंजक SYBR हरे मैं और SYBR सोना । यह प्रतिक्रिया नीली बत्ती या सूरज की रोशनी की उपस्थिति में काम किया और बेहतर गुणवत्ता के साथ एक यूवी transilluminator के साथ एसजी I के उपयोग की तुलना में नमूना वसूली की अनुमति दी । इस कागज का उद्देश्य tetrazolium लवण का उपयोग कर धुंधला तकनीक का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एनबीटी की कमी और एसजी के इस्तेमाल के आधार पर एक संवेदनशील और उपन्यास डीएनए धुंधलाने की विधि इस लेख में प्रस्तुत की गई । इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम है nbt-एसजी I सॉल्यूशन और एनबीटी की एकाग्रता में जेल ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), चिली, परियोजना १११३०२६३ (cw), परियोजना CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional पीसीआई-PII20150073 (cw) और यू-inicia से Vicerrectoría de द्वारा समर्थित किया गया Investigación Universidad डे चिली (CW) ।
इस परियोजना के प्रारंभिक चरण में मदद के लिए तातियाना Naranjo-पाल्मा के लिए धंयवाद, डॉ जॉर्ज Babul और डिएगो Quiroga-सहायक चर्चा के लिए रोजर, रॉबर्ट Lesch पांडुलिपि और Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y संशोधन के लिए Universidad डे चिली से Farmacéuticas । धंयवाद भी संपादन के लिए वीडियो और नील स्टीवंस के लिए Marcelo Pérez पाठ और आवाज प्रदान करने के लिए Errol वाटसन से अधिक को ठीक करने के लिए ।
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
