DNA flekker metode basert på Formazan nedbør forårsaket av blå lyseksponering
Summary
Denne metoden kan selektiv flekker og kvantifisering av DNA i gelé av soaking gel i en SYBR grønn jeg / Nitro blå Tetrazolium løsningen og deretter avslørte det sollys eller en blå lyskilde. Dette gir en synlig utløse og krever nesten ingen utstyr, gjør det ideelt for feltbruk.
Abstract
DNA flekker metoder er svært viktig for biomedisinsk forskning. Vi laget en enkel metode som tillater DNA visualisering for det blotte øye med dannelsen av en farget utløse. Det fungerer ved å nyte akrylamid eller agarose DNA gel i en løsning av 1 x (tilsvarer 2.0 µM) SYBR Green jeg (SG jeg) og 0.20 mM nitro blå tetrazolium som produserer en lilla føre til formazan når de utsettes for sollys eller spesielt blått lys. Også ble DNA utvinning tester utført med en ampicillin motstandsdyktig plasmider i en agarose gel med vår metode. Et større antall kolonier ble hentet med vår metode enn med tradisjonelle flekker med SG med ultrafiolett belysning. Metoden beskrevet er rask, bestemt og ikke-giftig for DNA deteksjon, slik at visualisering av biomolecules til “blotte øye” uten en transilluminator, og er rimelig og egnet for feltbruk. For disse grunner har vår nye DNA flekker metoden fordeler til både forskning og industri.
Introduction
Med fremskritt innen biokjemi og molekylærbiologi, har studier med DNA nødvendig bedre teknikker for å analysere DNA. Den første metoden for DNA flekker var sølv flekker, som er svært følsomme men mangler selektivitet og tillater ikke prøve gjenoppretting. Senere tillatt utvikling av fluorescerende DNA flekker selektiv kvantifiseringen DNA med mulighet for eksempel utvinning. En av de første fluorescerende fargestoffer brukes for DNA kvantifisering var ethidium bromide1, som er mutagent2. Men nå det er forbedret fluorescerende fargestoffer som er sikrere og mer følsomme, som GelRed og SYBR Green jeg (SG jeg)3; men alle disse fluorescerende fargestoffer krever bruk av en ultrafiolett (UV)-transilluminator eller fluorimeter.
Det er andre teknikker for synlig flekker DNA, som methylene blåfarge4 og crystal violet,5,,6,,7,,8,,9, men alle disse lider av redusert følsomhet og selektivitet. Tetrazolium salter er organiske forbindelser utsatt for reduksjon, og når dette skjer de danner en uløselig og farget formazan føre til10,11. Nylig har noen bivalent tetrazolium salter vist å binde til DNA på grunn av deres positive tetrazolium ringer12.
I en fersk publikasjon13, ble en ny synlig teknikk flekken og kvantifisere DNA i polyakrylamid gels foreslått, med reduksjon av et bivalent tetrazolium salt kalt nitro blå tetrazolium (NBT) og fluorescerende fargestoffer som ethidium bromide, GelRed, SYBR grønne jeg og SYBR gull. Denne reaksjonen jobbet i nærvær av blått lys eller sollys og tillatt prøve gjenoppretting med bedre kvalitet forhold til bruk av SG jeg med en UV-transilluminator. Målet med denne utredningen er å gi detaljert protokollen flekker teknikken bruker tetrazolium salter.
Protocol
Representative Results
Discussion
En følsom og romanen DNA flekker metode basert på reduksjon av NBT og bruk av SG jeg ble presentert i denne artikkelen. Det kritiske trinnet i denne protokollen er den inkubasjon tiden av gel i NBT-SG jeg løsning og konsentrasjonen av NBT. Den flekker agarose gels er lenger enn til akrylamid gels på grunn av større tykkelsen på agarose gels. Denne metoden fungerer ikke bra i nærvær av SDS som NBT precipitates i kontakt med den. Hvis gel får en lilla bakgrunn, anbefaler vi at en annen gel være forberedt og redus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, Project 11130263 (til CW), prosjektet CONICYT ++ NERC Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (til CW) og U-inicia fra de Vicerrectoría Investigación Universidad de Chile (til CW).
Takk til Tatiana Naranjo-Palma for hjelp i den innledende fasen av dette prosjektet, Dr. Jorge Babul og Diego Quiroga-Roger nyttig informasjon, Robert Lesch for revisjon av manuskriptet og Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas fra Universidad de Chile. Takk også til Marcelo Pérez for redigering av video og Neil Stevens for å korrigere tekst og Errol Watson for å gi voice-over.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
