DNA färgning metod baserad på Formazan nederbörd induceras av blå ljus exponering
Summary
Denna metod tillåter Selektiv färgning och kvantifiering av DNA i geler genom blötläggning gelen i en SYBR Green jag / Nitro Blue Tetrazolium lösning och sedan utsätta den för solljus eller en blå ljuskälla. Detta producerar en synlig fällning och kräver nästan ingen utrustning, vilket gör den idealisk för användning i fält.
Abstract
DNA färgning metoder är mycket viktiga för biomedicinsk forskning. Vi har utformat en enkel metod som gör DNA visualisering för blotta ögat vid bildandet av en färgad fällning. Det fungerar genom att blötlägga akrylamid eller agaros DNA gel i en lösning av 1 x (motsvarar 2,0 µM) SYBR Green jag (SG jag) och 0,20 mM nitro blue tetrazolium som producerar en lila fällningen av formazan när de utsätts för solljus eller speciellt blått ljus. Även utfördes DNA återhämtning tester med en ampicillin resistenta plasmid i en agarosgel färgas med vår metod. Ett större antal kolonier erhölls med vår metod än med traditionella färgning med SG jag med ultraviolett belysning. Den beskrivna metoden är snabb, specifika och icke-giftiga för DNA detektering, möjliggör visualisering av biomolekyler ”blotta ögat” utan en transilluminator, och är billig och är lämpliga för användning i fält. Av dessa skäl har vår nya DNA färgning metod potentiella fördelar för både forskning och industri.
Introduction
Med framsteg inom biokemi och molekylär biologi, har i studier på DNA krävs bättre tekniker för att analysera DNA. Den första metoden för DNA färgning var silver färgning, som är mycket känslig men saknar selektivitet och tillåter inte provet återhämtning. Senare, tillåtet utvecklingen av fluorescerande DNA färgning selektiv kvantifiering av DNA med möjligheten till provet återhämtning. En av de första fluorescerande färgämnen används för DNA kvantifiering var etidiumbromid bromid1, som är mutagena2. Men nu finns det förbättrade fluorescerande färgämnen som är säkrare och mer känsliga, såsom GelRed och SYBR Green jag (SG jag)3. men alla dessa fluorescerande färgämnen kräver användning av en ultraviolett (UV) transilluminator eller fluorimeter.
Det finns andra tekniker för synbart färgning DNA, såsom metylenblått4 och kristallviolett5,6,7,8,9, men alla dessa lider av minskad känslighet och selektivitet. Tetrazolium salter är organiska föreningar som är mottagliga för minskning, och när detta händer de bilda en olöslig och färgade formazan fällningen10,11. Vissa bivalent tetrazolium salter har nyligen visat att binda till DNA på grund av sin positiva tetrazolium ringar12.
I en senaste publikation13föreslogs en ny synlig teknik att fläcken och kvantifiera DNA i polyakrylamidgeler, med hjälp av minskning av ett bivalent tetrazolium salt kallas nitro blue tetrazolium (NBT) och fluorescerande färgämnen som etidiumbromid, GelRed, SYBR Green I och SYBR guld. Denna reaktion arbetade i närvaro av blått ljus eller solljus och tillåtet prov återhämtning med förbättrad kvalitet i förhållande till användningen av SG I med en UV-transilluminator. Syftet med denna uppsats är att tillhandahålla ett detaljerat protokoll av färgning tekniken använder tetrazolium salter.
Protocol
Representative Results
Discussion
En känslig och roman DNA färgning metod baserad på minskning av NBT och användningen av SG jag presenterades i denna artikel. Det kritiska steget i detta protokoll är inkubationstiden av gelen i NBT-SG jag lösning och koncentrationen av NBT. Agaros gel färgning tid är längre än för akrylamid geler på grund av den större tjockleken av agaros gel. Denna metod fungerar inte väl i närvaro av SDS som NBT fällningar i kontakt med den. Om gelen erhåller en lila bakgrund, rekommenderar vi att en annan gel vara b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, projektet 11130263 (till CW), projektet CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (till CW) och U-inicia från Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (till CW).
Tack till Tatiana Naranjo-Palma för hjälpen i det inledande skedet av projektet, Dr Jorge Babul och Diego Quiroga-Roger för bra diskussion, Robert Lesch för att revidera de manuskript och Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas från Universidad de Chile. Tack också till Marcelo Pérez för redigering av video och Neil Stevens för att korrigera texten och Errol Watson för att tillhandahålla voice-over.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
