Multiplexés Immunofluorescence analyse et Quantification d’intratumorale PD-1+ + Tim-3 CD8+ T Cells
Summary
Étudier le microenvironnement tumoral peut identifier des biomarqueurs pronostiques ou prédictifs de la réponse clinique à l’immunothérapie. Présentée ici, une méthode innovatrice repose sur in situ par fluorescence multispectrale d’imagerie permettant d’analyser et de compter automatiquement différentes sous-populations de CD8+ T des cellules. Cette technique fiable et reproductible est adaptée pour les analyses de cohorte importante.
Abstract
Les cellules immunitaires sont des composantes importantes du microenvironnement tumoral et influer sur la croissance tumorale et l’évolution à toutes les étapes de la cancérogenèse. Notamment, il est maintenant bien établi que le système immunitaire infiltrent dans les tumeurs humaines peut corréler avec le pronostic et la réponse au traitement. L’analyse de l’infiltrat immunitaire dans le microenvironnement tumoral est devenu un enjeu majeur pour la classification des patients et la réponse au traitement.
La co-expression de récepteurs inhibiteurs tels que le programme Cell Death Protein 1 (PD1 ; également connu sous le nom CD279), Lymphocyte T cytotoxique associé protéines 4 (CTLA-4), lymphocytes immunoglobuline et mucine contenant des protéines-3 (Tim-3 ; également connu sous le nom CD366) lymphocytaire Activation de gènes 3 (gal-3, aussi connu sous le nom CD223), est une caractéristique de l’épuisement de lymphocytes T. Nous avons développé une immunofluorescence multiparamétriques in situ afin d’identifier et de quantifier au niveau cellulaire la co-expression de ces récepteurs inhibiteurs de coloration. Sur une série rétrospective de tissus congelés de carcinomes des cellules rénales (CCR), à l’aide d’une technologie d’imagerie multispectrale fluorescence couplée avec une analyse d’images, il a été constaté que la co-expression de PD-1 et Tim-3 sur tumeur infiltrant CD8+ T des cellules est corrélée à un mauvais pronostic dans la RCC. À notre connaissance, cela représente la première étude démontrant que cela automatisé technologie multiplex in situ peut avoir une certaine pertinence clinique.
Introduction
Dans quelques années, l’immunothérapie est devenue un traitement très prometteur pour de nombreux types de cancers, dont le RCC. En particulier, immunothérapie, basée sur l’inhibition des points de contrôle inhibiteurs comme PD-1 et CTLA-4 a été signalé à être cliniquement efficace1,2,3,4,5, 6. anticorps monoclonaux contre CTLA-4, PD-1, ou programme mort Ligand 1 (PD-L1) ont déjà été approuvés dans plusieurs types de cancers et conduire à des réponses cliniques durables dans plus de 20 % des patients7. Néanmoins, pas tous les patients sont les intervenants, le coût du traitement est élevé, et ces traitements sont toxiques, conduisant à des potentiels graves effets secondaires de type auto-immune. Par conséquent, le défi actuel est d’identifier des marqueurs prédictifs de ces nouvelles immunothérapies. Le taux de mutations dans la tumeur, l’expression de PD-L1 ou les niveaux d’intratumorale CD8+ infiltration de lymphocytes T ont été signalés en corrélation avec la réponse clinique. Cependant, cette association est encore trop faible pour recommander l’utilisation de ces biomarqueurs cliniques en pratique clinique, à l’exception de l’essai de compagnon pour PD-L1 avant l’administration de la Pembrolizumab en non-small cell lung cancer (NSCLC) patients8 ,9,1011,12. Il a été démontré que la co-expression de nombreux récepteurs inhibiteurs comme PD-1, Tim-3, 3-Lag, et CTLA-4, induit un phénotype épuisement cellulaire et la résistance à la thérapie13,14,15. Puisque le sang périphérique n’est pas représentatif du microenvironnement tumoral, c’est d’un grand intérêt à analyser les caractéristiques phénotypiques de la cellules in situ. PD-1 et Tim-3 cellules T exprimant conjointement sont connus pour être des cellules fonctionnellement altérées dans plusieurs contextes13,16,17. Dans cette étude, l’impact pronostique de la co-expression des deux récepteurs inhibiteurs PD-1 et Tim-3 sur CD8+ T des cellules a été évaluée.
Jusqu’à présent, étudier la co-expression de multiples marqueurs sur tumeur infiltrant les lymphocytes (TILs) a principalement été réalisée par analyse en cytométrie en flux, rend nécessaire de travailler sur les tumeurs fraîches et donc excluant des analyses rétrospectives. Traditionnels in situ de coloration, coloration seule à la fois peut être effectuée, et la caractérisation du type qui a exprime les marqueurs n’est pas possible. Par exemple, PD-L1 est exprimée par de nombreux types de cellules du microenvironnement tumoral, rendant difficile de définir par immunohistochimie conventionnelle analyse quelles cellules exprimant PD-L1 sont les plus pertinents pour les études de corrélation. Dans ce travail, nous avons développé une méthode d’immunofluorescence multiparamétriques innovatrice in situ avec comptage informatique pour mettre en corrélation la co-expression de PD-1 et Tim-3 par tumeur infiltrant CD8+ T-cellules, avec des résultats cliniques dans la RCC. Cette technique présente plusieurs avantages, y compris la possibilité d’analyser au niveau unicellulaire et marqueurs multiples en même temps à l’aide d’une caméra multispectrale qui peut capturer des intervalles limités > 10 nm à travers des cristaux liquides filtres18. En outre, la procédure est automatique ce qui permet une reproductibilité entre opérateurs et une analyse raccourcie par rapport aux techniques manuelles19. Dans le domaine du cancer, plusieurs études ont rapporté convaincre plusieurs salissures des molécules immunitaires comme PD-1, PD-L1 et CD8 dans la cellule de Merkel carcinome, cancer du poumon et tête et du cou du cancer20,21,22, 23. le nombre d’éléments automatisés est possible avec une formation par l’utilisateur (étape de la détermination du phénotype). La fluorescence est mesurée dans les compartiments cellulaires (membrane, cytoplasme et noyaux).
Ici, les différents sous-ensembles d’infiltration tumorale de CD8+ T des cellules exprimant PD-1 et/ou Tim-3 dans une grande cohorte de RCC étaient comptés et les résultats ont été corrélés avec des scores de gravité clinique et les paramètres de survie. Il était également possible d’analyser l’intensité de fluorescence membranaire à la résolution cellulaire avec des données de Fluorescence de moyenne intensité (MFI) comme en cytométrie en flux. Pour autant que nous le savons, cela représente les première déclaration pronostique résultats de l’étude à l’aide de cette technique de comptage des fonction d’imagerie multispectrale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifications et dépannage :
La qualité du tissu est un paramètre important ; Il peut être facilement vérifiée par coloration hématoxyline et éosine.
Un des avantages de la technique est la possibilité de salissures multiplexé, mais pour éviter tout débordement de fluorophore, il est recommandé de choisir des longueurs d’onde d’émission avec delta de 10 minimum nm. Ici, parce que nous avons eu 4 salissures y compris DAPI, nous av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut National du Cancer (INCA) (HE), Ligue contre le Cancer (HE), Université Sorbonne Paris Cité (HE), ANR (Selectimmunco) (HE), Labex Immuno-oncologie (HE), SIRIC CARPEM (CG, ET). GDE a été financée par une bourse de la Fondation ARC. EV et CD ont été financées par une bourse de l’APHP (recherche de bourse d’année). ChB est financé par une bourse de recherche de l’Université Sorbonne Paris Cité (contrat doctoral). Les auteurs remercient Bristol Myers Squibb pour leur financement dans ce projet. Les auteurs remercient le département de pathologie de l’Hôpital Européen Georges Pompidou et Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel et Gisèle Legall). Les auteurs remercient la plate-forme de l’histologie des rendez-vous, Hôpital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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