Summary
研究肿瘤微环境可以确定预后或预测的标志物的临床反应免疫治疗。本文介绍了一种基于原位荧光多光谱成像的创新方法, 对 CD8+ T 细胞的各种亚群进行自动分析和计数。这种可重现和可靠的技术适用于大型队列分析。
Abstract
免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分, 在癌变的各个阶段影响肿瘤的生长和进化。值得注意的是, 现在已经证实, 人体肿瘤的免疫渗透可以与预后和治疗反应相关联。对肿瘤微环境中免疫浸润的分析已成为患者分类和治疗反应的主要挑战。
抑制受体的共同表达, 如程序细胞死亡蛋白 1 (PD1; 也称为 CD279), 细胞毒 t 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4), t 细胞免疫球蛋白和含 Protein-3 (Tim-3, 也称为 CD366), 淋巴细胞活化基因 3 (Lag-3, 也称为 CD223), 是 T 细胞衰竭的标志。我们开发了一个多的原位免疫荧光染色, 以确定和量化的细胞水平, 这些抑制受体的共同表达。在回顾性肾细胞癌 (RCC) 冰冻组织中, 应用荧光多光谱成像技术与图像分析软件结合, 发现 PD-1 和 Tim-3 对肿瘤浸润 CD8+ T 细胞的联合表达与碾压混凝土的预后差相关。根据我们的知识, 这是第一个研究表明, 这种自动复用的原位技术可能有一些临床相关性。
Introduction
在过去的几年中, 免疫治疗已经成为一种非常有前途的疗法, 许多类型的癌症, 包括 RCC。特别是, 基于抑制像 PD-1 和 CTLA-4 等抑制检查站的免疫疗法已被报告为临床有效的1,2,3,4,5,6. 抗 CTLA-4、PD-1 或程序死亡配体 1 (PD-L1) 的单克隆抗体已在几种癌症中获得批准, 并导致20% 以上患者的长期持续临床反应7。然而, 并非所有的病人都是应答者, 治疗的费用很高, 这些治疗是有毒的, 导致潜在的严重的自身免疫性副作用。因此, 当前的挑战是确定那些新的免疫的预测标记。据报道, 肿瘤的突变率, PD-L1 的表达, 或 CD8 细胞浸润的水平, 与临床反应相关.然而, 该协会仍然过于薄弱, 建议在临床实践中使用这些临床生物标志物, 除了在非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的 Pembrolizumab 前 PD-L1 的同伴试验,8 ,9,1011,12。结果表明, PD-1、Tim-3、Lag-3 和 CTLA-4 等多种抑制受体的共同表达, 诱导细胞衰竭表型和抗性治疗13,14,15。由于外周血不是肿瘤微环境的代表, 因此, 分析细胞的表型特征原位是很有意义的。PD-1 和 Tim-3 共表达 T 细胞已知是功能受损的细胞在几个上下文13,16,17。在这项研究中, 评估了两个抑制受体 PD-1 和 Tim-3 在 CD8 的 T 细胞上的共同表达对预后的影响.
到目前为止, 研究多标记物在肿瘤浸润淋巴细胞 (til) 中的协同表达主要是通过流式细胞仪分析进行的, 因此有必要对新鲜肿瘤进行研究, 从而排除回顾性分析。与常规的原位染色, 一次只能进行一次染色, 而与表达标记的细胞类型的表征是不可能的。例如, PD-L1 是由肿瘤微环境的许多细胞类型表达的, 使得传统的免疫组织化学分析难以定义 PD-L1 细胞的表达与相关研究的相关性更大。在这项工作中, 我们开发了一个创新的原位多免疫荧光法与计算机计数, 以关联 PD-1 和 Tim-3 的共同表达的肿瘤浸润 CD8+ T 细胞与临床结果在 RCC。这项技术有几个优点, 包括有可能在一个单一的细胞水平和多个标记同时使用多光谱相机, 可以捕获限制的时间间隔 > 10 nm 通过液晶滤镜18。此外, 该过程是自动的, 使互操作性和缩短分析相比, 手动技术19。在癌症领域, 几项研究报告有说服力的多染色免疫分子如 PD-1, PD-L1, 和 CD8 在默克尔-细胞癌, 肺癌, 头颈癌20,21,22,23. 通过用户的培训 (分步骤), 可以实现自动单元计数。荧光是在不同的细胞室 (细胞核, 细胞质, 和膜) 测量。
在大量的碾压混凝土中, 不同的肿瘤浸润 CD8+ T 细胞表达 PD-1 和/或 Tim-3, 结果与临床重力评分和生存参数相关。在细胞分辨率下, 也可以利用细胞内的平均荧光强度来分析细胞膜的荧光强度。据我们所知, 这是第一次使用这种基于多光谱成像的计数技术报告预后结果的研究。
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Protocol
这项研究是按照《赫尔辛基宣言》进行的, 并得到当地道德委员会 (2012-05-04) 的批准。从参与人中获得了知情同意。
1. 组织材料
- 在手术当天收集碾压混凝土组织标本。在室温下处理手术标本 (病理科)。
- 在干管中收集大约0.5 厘米 x 0.5 cm x 0.5 厘米大小的肿瘤样本。在液氮中冷冻, 贮存在-80 ° c。
- 将样品涂在最佳切削温度复合物上。部分样品与低温在-20 ° c 入 4-6 µm 厚实的部分。让样品的空气干燥12小时, 并直接储存在-80 ° c, 以避免干燥。
- 通过查看苏木精和曙红染色切片检查样品的质量。
2.原位til 免疫荧光染色
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程序指南
- 在室温下执行所有实验步骤。
- 对于所有步骤, 执行稀释与三缓冲盐水 (TBS; 请参见材料表)。
- 除主抗体孵育后, 在 TBS 中执行所有步骤的洗涤。对于后者, 使用三缓冲盐水 Tween20 (TBST, 请参阅材料表)。对于缓冲区组成和重构, 请参见补充表 1。
- 使用湿度室的抗体孵化和染色罐洗涤。
- 在手术过程中不要让部分干涸。
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预处理
- 将含有组织样品的幻灯片解冻, 并用纸巾小心地将试样周围的滑动干燥。用疏水屏障笔界定包含组织的反应区域 (请参见材料表)。干燥2分钟。
- 将100% 丙酮中的样品固定5分钟, 干燥2分钟, 用 TBS 洗涤10分钟。
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饱和和封锁
- 预处理的幻灯片为10分钟, 3 滴素 0.1%, 点击和/或轻弹幻灯片, 以分发素和消除气泡, 然后治疗10分钟与3滴的生物素 0.01% (见材料表), 点击, 和/或轻弹。用 TBS 洗。
- 执行 Fc 受体阻滞。应用100µL 5% 体积/体积的正常血清稀释在 TBS. 使用同一寄主物种的血清作为标记的二级或三级抗体 (见材料表);在这里, 驴血清被使用。孵育30分钟。
- 在孵化期间, 简要地旋转 anti-CD8、PD-1 和 Tim-3 抗体 (材料目录)。准备在 TBS 的主要抗体混合, 如补充表 2中所述。
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CD8、PD-1 和 Tim-3 的免疫染色
- 准备主抗体混合物。有关所使用的抗体 (anti-CD8、PD-1、Tim-3 及其相应的二级抗体) 及其浓度, 请参阅材料表和补充表 2 。
- 轻拍和/或挥出剩余的驴血清 (添加在步骤 2.3.2)。用100µL 的非标记主抗体混合在湿化室中孵育1小时的幻灯片。
- 在孵化期间, 简要地旋转青菁5抗兔, AF488-anti-goat, 和化抗鼠抗体, 并准备在补充表 2中描述的二次抗体混合。
- 在 TBST 中清洗幻灯片5分钟。
- 在湿化室中孵育30分钟的二次抗体的100µL 的幻灯片。
- 如补充表 2所述, 准备含有 Cy3-streptavidin 的三级抗体混合物。
- 在 TBS 中冲洗幻灯片10分钟, 烘干幻灯片。
- 孵育的幻灯片与100µL 的第三抗体混合物30分钟。
- 在 TBS 中冲洗幻灯片10分钟, 烘干幻灯片。
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单元安装
- 安装在 4 ", 6-Diamidino-2-吲, 盐酸 (DAPI)-包含安装介质 (1.5 µg/毫升 DAPI) 与片兼容荧光显微镜 (见材料表) 的幻灯片。
注意: 作为对每项实验的阴性对照, 一张与同种匹配的抗体的滑动与相应的抗体浓度相同。对于这种染色, 我们使用了小鼠 IgG1, 兔 igg, 和山羊 igg 阴性控制抗体 (参见材料表)。作为一个积极的控制, 我们使用人类增生扁桃体, 这是已知的是积极的测试标记, 每一个实验。结果中描述了一个典型的染色 (图 1)。CD8、PD-1 和 Tim-3 的单染色应单独进行 (每张幻灯片染色一次), 并进行相同的前处理和无 DAPI。在同样的实验条件下, 没有任何抗体和只有 DAPI 安装介质的滑动也应进行。一张幻灯片应使用相同的实验条件, 没有任何抗体和没有 DAPI 成像。
- 安装在 4 ", 6-Diamidino-2-吲, 盐酸 (DAPI)-包含安装介质 (1.5 µg/毫升 DAPI) 与片兼容荧光显微镜 (见材料表) 的幻灯片。
3. 荧光分析和自动细胞计数
- 图像采集与自动显微镜
- 创建一个协议。
- 打开自动显微镜软件和荧光照明灯。
- 在菜单栏中, 单击 "文件"、"创建协议"、"选择 DAPI"、"FITC" 和 "TRITC"。
- 单击 "下一步"、"组织部分", 然后单击 "下一步"、"协议名称"。选择一个名称, 例如, "CD8-PD-1-Tim-3", 单击 "下一步" 和 "保存"。
- 手动将幻灯片放在舞台上。
- 在菜单栏中, 单击 "安装"、"设置"。在新窗口中单击 "设置主页 Z"。
- 使用正控制滑块调整曝光时间即CD8、PD-1 和 Tim-3 三重染色的 DAPI 样本。
- 在控制栏中单击 "设置曝光"。
- 调整每个滤镜的曝光时间, 直到获得足够但不饱和的信号。
- 对于单色成像, 请执行以下操作:
- 选择购置和在 ' 自动对焦 ' 选择 DAPI 过滤器。
- 在 "扫描区域限制" 中, 将目标上移到幻灯片的左上角。单击 "标记"。在右下角做同样的事情。
注: 此步骤 delimitates 4X 低功耗成像 (LP 成像) 的区域;注意将标记放置好, 以便围绕系列的所有示例。 - 对于大功率 (HP) 成像, 请执行以下操作:
- 在 "自动对焦" 下, 选择 "DAPI"。
- 在 "获取" 波段下, 选择 "DAPI"、"FITC"、"Cy3" 和 "Cy5"。单击 "确定"。在菜单栏上单击 "文件", "保存协议"。
- 扫描幻灯片。
- 通过单击菜单栏中的 "文件"、"加载协议" 来加载协议。单击 "开始"。
- 输入 "实验室 ID" (用于图像存储的文件夹位置)。输入幻灯片 ID 以标识幻灯片。单击 "下一步"。
- 单击 "单色成像" (在明亮的光场下扫描整个幻灯片, 并使用4x 目标获取序列图像)。
注意: 这将生成幻灯片的灰度概览。 - 点击 "查找标本"。选择低分辨率扫描的组织区域 (4x): 按住 Ctrl 键并使用光标单击字段以选择或取消选中字段 (图 2A)。
- 单击 "LP 成像" (4x 成像), 获取每个字段的荧光红蓝绿色图像。
- 对于 HP 字段选择, 按住 "Ctrl" 键并使用光标单击字段以选择或取消选中与将在高分辨率 (20x) 扫描的组织区域相对应的字段。选择5字段 (图 2B)。
- 单击 "HP 成像" (20x 成像), 获取每个字段的多光谱图像 (图 2C)。
- 单击 "数据存储" 以将图像存储在 LabID 开始处选定的文件夹中。
注意: 该过程在图 2中进行了总结和说明。对于每个步骤 (组织检测, 字段选择), 一个算法可以增加和培训的用户对整个自动化扫描过程。
- 创建一个协议。
- 用耦合分析软件进行荧光图像分析和自动计数
- 构建频谱库。
- 打开图像分析软件。
- 在左侧面板中, 打开 "生成库"。在 "加载图像" 下, 单击 "浏览" 并选择一个单声道彩色图像 (例如, CD8/Cyanine 5)。
- 选择荧光, (例如, 菁 5)。单击 "提取"。单击 "保存" 以存储在库中。单击 "保存"。
- 重复相同的过程, PD-1, Tim-3, 和 DAPI 单染色幻灯片, 以整合的频谱, 每荧光的兴趣。
注意: 构建频谱库集成了用于特定组织 (这里, 肾脏) 的每个荧光的频谱, 但是已经存在的 "合成" 库可以使用。由于自体荧光光谱是严格的相对于组织, 它是重要的是执行一个自动萤光和光谱库的每个项目。
- 创建新项目。
- 从菜单栏中, 单击 "文件"、"新建项目"。在 "查找功能" 选项卡中, 选择 "单元格分割"。在 "分" 选项卡中, 选择 "分"。单击 "创建"。
- 将代表图像集成到项目中。
- 在 "文件" 选项卡上, 单击 "打开图像"。选择10到30代表性的整个系列图像。添加非着色幻灯片以删除荧光。在右侧面板: 选择库源。选择荧光并选择对应于以前构建的频谱库的。
- 要去除组织的自发荧光, 请单击 "AF 按钮", 然后选择空白幻灯片上的自发荧光区域。
- 图像处理和复合图像生成。
- 单击 "准备全部" 以集成荧光库和自发荧光光谱来生成复合图像 (图 3)。单击 "眼睛" 图标打开 "视图编辑器" 面板, 然后选择显示的数据: 选择 CD8、PD-1、Tim-3 和 DAPI 的标记。去掉荧光。按照软件提供的步骤操作。
- 分割单元格。
- 要分割细胞, 在 ' 隔间 ', 选择 "细胞核" 和 "膜"。在 "细胞核" 标签中, 设置 DAPI 为核 counterstain。
- 在 "最大和最小大小 (px)" 选项卡中分别输入 "40" 和 "176" 作为最小和最大大小。对于 "最小" 信号, 设置 "0.13"。在 "拆分" 选项卡中, 设置 "2.60"。在 "细胞核" 标签中, 设置 "0.81"。选择 "使用膜信号帮助分割"。
- 单击屏幕底部的 "分段单元格"。检查细胞的细胞核和细胞膜的分割, 如果不符合细胞的 DAPI 和细胞膜荧光, 则重试不同的参数。
注: 该软件识别的细胞与核 DAPI 染色, 并根据细胞大小。根据项目调整单元格参数 (大小、拆分、像素)。
- 细胞表型。
- 在 "表型" 标签中, 单击 "添加"。创建细胞表型分类: CD8 (蓝点)/CD8-pd-1 (红点)/CD8-pd-1-Tim-3 (绿点)/其他 (黑点) (图 4)。
- 选择每个类别中5多个单元格的示例。单击 "训练分类器"。
注意: 这个软件生成了一个统计分类算法。 - 点击 "表型全部" 获得每个细胞的表型。
注: 该软件给出了一个具有置信区间 (CI) 精度的细胞表型。 - 通过训练软件改进算法, 直到眼睛和自动计数之间的差异是一致的 (错误 < 5%)。选择对感兴趣的单元格可以接受的 CI。
注: 我们选择在 55% CI 的基础上进行培训, 可以接受。
- 保存算法和项目。
- 在 "文件" 下选择 "项目"。命名它并单击 "保存"。
- 对系列进行批量分析。
- 选择 "批次分析"。选择项目。添加要分析的图像。为数据选择一个存储文件夹。单击 "运行"。检查复合图像的质量。验证该系列的所有图像的分。
注: 耦合图像分析软件集成了所有的细胞隔间 (膜/细胞质/核) 信号。分步骤是至关重要的, 尽管算法的训练可以是一个耗时的步骤。每个图像的所有数据都在一个 .txt 文件中。一个细胞的所有数据 (特别是它的表型给与它的 CI) 在一条线。对于每张幻灯片, 图像获取和后续计数都在5字段上执行。
- 选择 "批次分析"。选择项目。添加要分析的图像。为数据选择一个存储文件夹。单击 "运行"。检查复合图像的质量。验证该系列的所有图像的分。
- 构建频谱库。
- 原始数据的综合化和自动细胞计数的世代
- 用统计程序计算数据。
- 计算所有的数据从5图像对应的5字段分析为1患者。使用统计平台, 有经验丰富的统计学家、数据管理人员或数据科学家进行分析。建立一个脚本, 自动计数的细胞取决于他们的表型, 选择 CI > 55%。
- 将该系列的所有 .txt 文件放在同一个文件夹中。
- 提取数据。
- 将所有 .txt 文件放在一个文件夹中。运行在步骤3.3.1 中构建的自动脚本。打开由 R 脚本生成的输出. csv 文件。另存为. xl 格式。输出为每个患者收集每个表型的单元格数 (即、单独的 CD8、CD8-PD-1、CD8-PD-1-Tim-3)。
- 计算每个字段每个患者的平均单元格数: 按字段个数 (即, 5) 划分单元格数, 以规范化每个字段每个患者的单元格数。
- 计算总 CD8+ t 单元格中的 PD-1+单元格的百分比, 在总 CD8 + t 单元格中 PD-1 + Tim-3+单元格。有关此步骤的摘要, 请参见图 5 。
注意: R 语言 (或其他编程软件的选择) 是需要正确的创建和执行命令, 所以有经验的用户或统计学家/数据科学家是必不可少的。R 程序可以计算同一病人的数据, 但一个病人的 5 .txt 文件的名称应该有一个相同的开始, 对应于一个独特的病人标识符。
- 用统计程序计算数据。
- 统计分析
- 使用统计软件对结果进行统计分析。
- 在统计学家的帮助下进行适当的统计分析。
- 使用非参数魏氏的签名秩测试, 比较 PD-1 在两个细胞表型之间 (图 6)。协和组织学特征与皮尔逊的 chi 平方检验相关联。
- 使用卡普兰-梅尔方法估计的进展自由生存, 和 Cox 回归模型, 以估计协影响的时间-事件的结果, 如整体生存和无病生存。
- 请考虑p-值小于0.05。
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Representative Results
使用上述的一般协议, 我们的目的是量化肿瘤 CD8+ T 细胞联合表达的抑制受体 PD-1 和 Tim-3 在冰冻组织的患者与临床结果25。
CD8/PD-1/Tim-3 染色的优化:
为了避免不同抗体之间的交叉反应, 选择了不同种类的抗体 (小鼠、兔和山羊, 见材料表)。该协议是在扁桃体, 这是一个有组织的淋巴组织验证。PD-1 染色可以在生发中心 (图 1) 中找到, 而 CD8 和 Tim-3 染色则存在于生发中心周围。这种典型染色的观察验证了该协议。该染色也证实了在利益组织 (肾脏)。
证实了与非相应的二级抗体孵育的主抗体没有信号 (未显示数据)。为了准确地分析荧光染色和制作特定的光谱库, 个别的幻灯片单独染色的每个标记 (CD8, PD-1, Tim-3, 或 DAPI) 在组织的利益 (肾脏)。在相同条件下的非染色滑动是推断组织的自发荧光的必要条件。采用自动显微镜对染色进行分析, 将不同荧光的频谱进行综合;每个标记都有很好的区分, 没有观察到标记的重叠 (图 3)。
CD8 的数量和定性特征+渗透到87碾压混凝土患者:
结果表明, 近似半 CD8+ T 细胞表达 PD-1 (平均 53.9%;SE: 30.49%), 大约三分之一是双正 PD-1+ Tim-3+ (平均为 38.16%;SE: 28.11%)。在不到3% 的 CD8+ T 单元格 (未显示数据) 中检测到不含 PD-1 表达式的 Tim-3 表达式。CD8 + T 细胞亚群的平均数目为: 总计 CD8+ t 单元格 116.5 (se: 216), PD-1+ CD8+t 单元格 89.32 (se: 191.8), PD-1+ Tim-3+ 66.9 (se: 143), PD-1+ Tim-3 CD8+ T 细胞 22.38 (SE: 57.5) 每个领域。CD8+ t 细胞的总数与 PD-1+ Tim-3+在 CD8+ t 细胞中的百分比呈正相关。
CD8 的功能特性+ T 细胞取决于他们的表型 PD-1 和 Tim-3:
PD-1 表达水平已知与 T 细胞衰竭相关, 因此我们下一步的目标是根据 Tim-3 表达式状态来测量 CD8+ t 单元格上的 PD-1 表达式。由于不同荧光的平均荧光强度报告的细胞水平, 一个小系列的病人被手动分析的细胞数据: 结果表明, PD-1 膜的细胞亚型的相关性。PD-1 荧光强度被测量了 (图 6) 在细胞水平上在 PD-1+ Tim-3+与 PD-1 + Tim-3 CD8+ T 细胞 (一个面板) 和在个人的病人水平后, 整合这些各种组织切片上的细胞信号。在一系列的9例患者中, 与魏氏配对试验的比较发现, PD-1 Tim-3 是更高的, 当联合表达, 加强 Tim-3 表达的功能相关性 (B 小组)。
多 PD-1 和 Tim-3 配体在肿瘤细胞表面的多项联合染色中的表达:
由于 T 细胞衰竭是介导的受体/配体相互作用, 我们评估了 PD-1 和 Tim-3 配基 (PD-L1 和 Galectin-9 (Gal-9) 的表达, 分别对肾肿瘤细胞的泛角蛋白染色鉴定。阳性被定义为10% 的肿瘤细胞表达的标记: (i) 58 的87例 (66%) 为 PD-L1 阳性;(ii) 所分析的15肿瘤均为阳性 Gal-9 (图 7A, B)。
Tim-3 联合表达的临床影响+PD-1+on CD8+ T 单元格:
肿瘤淋巴结转移 (TNM) 评分、马克·富尔曼评分、肿瘤大小、UISS 评分均为原发性碾压混凝土预后的组织学特征 (结合临床评分 UISS)。在所有这些参数 (表 1) 中, 肿瘤浸润的 CD8+ T 细胞表达 PD-1 和 Tim-3 (但不表示 PD-1 没有 Tim-3) 的数量和/或百分比之间存在正相关关系。与此更为贬义的表型, RCC 患者与 CD8 的+ T 细胞 co 表达 PD-1 和 Tim-3 以上的中位百分比 (34.7) 更容易复发 (p = 0.046;HR 2.9;95% CI: 1.02-8. 21)。在 CD8+ T 单元格上 PD-1 的百分比与 Tim-3 状态无关 (表 2), 未观察到这种相关性。还显示了 CD8+ T 细胞共表达 PD-1 和 Tim-3 的百分比与36月总体存活率 (未显示数据) 之间的相关性。我们还验证了扁桃体石蜡组织的三重免疫 (图 1)。
图 1: CD8-PD-1-Tim-3 免疫在扁桃体石蜡包埋组织上.石蜡包埋组织切片代替冷冻切片选择三免疫。在脱蜡和补液后, 采用了相同的染色方法, 用于冷冻切片。CD8+ t 单元格位于生发中心之外, non-CD8+ t 细胞表达 PD-1 在生发中心聚集。显微镜放大倍数为 20x, 刻度条代表20µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 肾细胞癌组织标本的自动分析.在明亮的领域图像组织识别 (A, 标尺1毫米), 4x 显微镜放大率低分辨率成像在 RGB (红色蓝色绿色常规荧光) 用于选择字段 (B, 缩放条形图500µm。整个红色方块代表一个字段。以多光谱显微镜进行20x 放大的高分辨率图像 (多光谱立方体荧光图像) 显示 (C, 缩放条形图100µm)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 多光谱显微镜和软件耦合分析, 以生成一个肾细胞癌 (20x 显微镜放大) 的复合图像.高分辨率原始图像 (A) 是荧光滤光片在多光谱扫描后的电场荧光图像。蓝色信号是 AF488, 红色是青菁 5, 绿色是 Cyanin3。合并显示不同的颜色例如, 黄色是三荧光的合并。此图像被合并到图像分析软件中。光谱库集成允许精确的频谱分离每个荧光和自发荧光导致一个荧光复合图像 (B)。代表性颜色由操作员选择: 蓝色说明了青菁 5 (CD8), 红色菁 3 (PD-1), 绿色 AF488 (Tim-3)。合并混合色如紫色用于 CD8-PD-1 双阳性。刻度栏代表20µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: PD-1 和 Tim-3 在肿瘤浸润的 CD8 细胞上的表达, 对透明细胞癌标本进行荧光多光谱成像技术 (20x 显微镜放大) 分析.(A) CD8 (蓝色)、PD-1 (红色) 和 Tim-3 (绿色) 在碾压混凝土患者的冰冻组织切片上染色。这三标记的定位可以通过合并单一染色的图片来检测。每个实验都进行同种控制。刻度栏代表20µm. 黄色方框识别 co 染色单元: Tim-3- PD-1+ CD8 单元格和 Tim-3+ PD-1+ CD8 单元格。(B) CD8、PD-1 和 Tim-3 (合并) 的三重 co 染色显示在左侧, 该框表示绿色是 CD8+ T 细胞共同表达的 PD-1 和/或 Tim-3。对于自动计数与图像分析软件, 识别细胞依赖于存在的核染色 (DAPI);细胞的分割也基于以红色边界 (中间板) 为代表的形态特征。由用户训练的算法, 直到与视觉计数的和谐执行 (正确), 并且在自动分以后, 辨认绿色点作为 CD8+ T 细胞 co 表达 PD-1 和 Tim-3, 红色点作为 CD8+ t 细胞表达 PD-1, 不用Tim-3 和蓝点作为 CD8 的+ T 细胞不表达 PD-1 或 Tim-3。刻度栏代表20µm. 黄色方框显示 PD-1 和/或 Tim-3 表示 CD8+ T 细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 计算多光谱分析的原始数据.在图像分析后收集每个字段中每个单元格类别 (即、5字段/患者、即、5 .txt 文件) 的计数数据。R 脚本结合5字段的数据, 只考虑细胞 phenotyped 与置信区间 > 55%。显微镜放大率为 20x, 刻度条代表100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: PD-1+ Tim-3+ CD8+ t 细胞表达更高水平的 PD-1 比较 PD-1 + Tim-3 CD8+ t 细胞在肾细胞癌。在单元格级别 (左侧面板) 中检测到 PD-1 的强度, 方法是在 PD-1 上进行原位免疫荧光分析+ Tim-3+和 PD-1 + Tim-3 CD8+ T 细胞。在个体水平 (中间小组): 结果显示为整个 CD8+ T 细胞子集 PD-1+ Tim-3+与 PD-1+ Tim-3-出现在组织切片上 (即, 一个病人;曼尼惠测试)。对9例 (右面板) 的平均 PD-1 强度进行了比较分析 (魏氏试验, p-低于0.05 的值被认为是显著的)。显微镜放大倍数为 20x, 刻度条代表10µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: PD-L1 和 Gal-9即PD-1 和 Tim-3 配体染色对肾细胞癌.(A) 肿瘤细胞通过泛角蛋白染色进行鉴定。PD-L1 和泛角蛋白 (一个小组) 的共同染色鉴定了58例肿瘤细胞中 PD-L1 的表达情况。(B) Galectin-9 在所有的15例肿瘤患者中进行了分析。阳性被认为, 如果至少10% 的细胞染色的标记分析。每个染色都包括同种控制。黄色方框代表 PD-L1 (面板 a) 或 Galectin-9 (面板 B) 的阳性肿瘤 (泛角蛋白 +) 细胞。显微镜放大倍数为 20x, 刻度条代表20µm.请单击此处查看此图的较大版本.
| %/CD8+ T 单元格 | PD-1+ | PD1+ Tim-3+ | PD-1+ Tim-3- |
| tnm | 0.04 | 0.003 | 0.22 |
| Furhman | 0.01 | 0.004 | 0.74 |
| 肿瘤大小 | 0.08 | 0.01 | 0.37 |
| UISS | 0.01 | 0.01 | 0.63 |
表 1: PD-1 单独或联合 Tim-3 对 CD8+ T 细胞的表达与患者临床预后参数的相关性: p-值。PD-1+、PD-1+ Tim-3+或 PD-1+ Tim-3 在 CD8 + T 单元格中选定为连续变量, 由原位免疫荧光法测定87例患者队列中的比例不同的临床参数定义为二元 (TNM, 马克·富尔曼级, UISS 评分) 或连续变量 (肿瘤大小)。TNM 分为两组: 局部疾病 (pT1 和 pT2) 和晚期疾病 (pT3、pT4、N+或 M+)。马克·富尔曼等级被定义为低 (I 级或 II) 和高 (III 或 IV 级), UISS 评分分为3类 (0、1和 2)。P-指示显式关联的值以粗体显示。
| CD8+ T 单元格 subset/CD8 | PD-1+ Tim-3+ | PD-1+ Tim-3- |
| 中位数 (%) | 34。7 | 8。6 |
| 与 PFS 的关联 | P = 0.046 | P = 0。8 |
表 2: PD-1 与 Tim-3 co 表达的相关性研究 CD8+ T 细胞和进展自由生存.两组 RCC 患者 (n = 87) 根据 PD-1 无 Tim-3 (右) 的百分比, PD-1 和 Tim-3 (左) 相对于中位数是个体化的。与 PFS 的相关性是以所选的中值作为切断的。P-指示显式关联的值以粗体显示。
补充表 1: TBS 和 TBST 的缓冲组成.TBS 用于抗体混合和稀释。对于洗涤, 所有步骤都是用 TBS, 除了主要的抗体, 在这里推荐 TBST 的洗涤。请单击此处下载此文件.
补充表 2: CD8-PD-1-Tim-3 免疫荧光染色的详细抗体混合成分.对于每一个主、二级和三级抗体混合体, 在相应的 TBS 体积内进行稀释, 总体积为1毫升。对于一张幻灯片, 所需的总反应体积为100µL, 用于 2 cm2的组织面积。请单击此处下载此文件.
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Discussion
修改和故障排除:
组织质量是一个重要的参数;它可以很容易地通过苏木精和曙红着色检查。
该技术的一个优点是可能的多路复用染色, 但为了避免荧光溢出, 它建议选择的发射波长的三角洲 10 nm 最小。在这里, 因为我们有4染色包括 DAPI, 我们选择展开波长 (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, 菁 3: 570 nm, 菁 5: 670 nm)。通过使用软件计算混合发射信号中的荧光的纯频谱, 并结合自动化图像分析, 避免了来自不同荧光的重叠信号的风险。单张染色的幻灯片也证实了荧光之间没有重叠, 并作为一个补偿感谢频谱库。
有时一个细胞内的一个标记的阳性可能很难确定染色/荧光是否弱。每个实验中包含的负控制是确定阳性阈值的好方法。
在用于分析图像的耦合软件中, 确定细胞阳性的评分步骤存在, 但只能同时分析两个标记。因为我们可以在同一单元格上进行三重染色 (CD8、PD-1 和 Tim-3), 所以我们选择了分步骤。
分步可能是费力的, 特别是如果染色的类型和背景是可变的从一个样品到另一个。
技术的局限性:
即使与常规荧光相比, 共染色的数量是一个优势, 但在流式细胞仪中也不可能分析出许多颜色。特别是当研究多个标记的定位时, 要注意与共焦显微镜相比更低的灵敏度 (20x 显微镜放大倍数, 大约0.5 µm 与0.1 µm 每像素的共焦, 取决于品牌) 和检查荧光溢出 (请参阅下面的协议中的关键步骤)。
技术的一个大局限是原始的数据格式。原始数据是 .txt 文件, 使用起来可能会很棘手。由于该软件以 CI 为表单的每张图像提供一个. txt 文件, 每个患者的5文件的手工治疗是非常费力的。需要一个生物信息学专家来计算统计软件中的所有数据。
关于现有方法的意义:
多路染色分析很容易实现。与分析新鲜样品的流式细胞仪相比, 这种技术允许快速计数在肿瘤微环境中存在的不同细胞亚群的可再生方法, 在大量冰冻样品中采用自动程序26 ,27。我们可以自动计数渗透 CD8+ T 细胞表达 PD-1 和共同表达 Tim-3 或不在设置的 RCC。自动计数避免了一些偏见, 如眼睛疲劳和不可再生计数, 并没有时间消耗。
由于研究的大型队列是在冰冻样本, 我们有追溯数据, 所以我们可以链接的绝对数量或百分比的 CD8+ T 细胞子集与生物学参数和临床结果。由于有一个重要的异质性的免疫渗透从一个病人到另一个28, 这是一个优势相比, fluorocytometry 只报告的, 但没有渗透等级。
对每个细胞的荧光强度进行了定量分析, 在不同的细胞室 (膜/胞质/核) 中, 我们可以对膜上的 PD-1 染色水平进行评价。这代表了另一个与流式细胞术相似的有趣的工具。我们发现 PD-1 的+ CD8+ T 细胞表达 Tim-3 有较高的 PD-1, 并与预后差 (影响进展自由生存)。据我们所知, 这是第一个使用这种方法的研究, 它显示了一个特定细胞子集的临床意义。
未来应用:
应用领域是巨大的。我们还强调了肺癌肿瘤的微环境另一种特定的细胞子集: 组织驻留记忆 T 细胞称为 TRM (CD103+ CD49a+), 它们与更好的整体生存能力相关21,29 ,30。在另一项使用这项技术的工作中, 我们的研究小组发现, PD-L1 是表达肺癌亚型中的肿瘤细胞与变性淋巴瘤激酶 () 重排, 这一表达式与 CD8+渗透10。该技术适用于多种环境下的临界生物参数的评价, 可作为标记物发现的重要工具。由于 xy 坐标给出, 它是第一个工具, 研究地形和细胞/细胞之间的相互作用, 轻松31。
协议中的关键步骤:
其中一个关键步骤是优化的联合染色, 这可以是费时。选择一个好的抗体是至关重要的, 例如, 多个克隆已经测试了 Tim-3 在目前的情况下。另外, 同一个标记的不同荧光可以给出不同的结果, 所以尝试几个组合是很重要的。建议使用不应共同反应的抗体检查染色特异性。尽管有可能同时分析多个荧光, 但建议使用单染色幻灯片检查溢出。另一个关键的步骤是分的步骤, 它依赖于手工训练来仔细地执行。
在总体上, 熟练操作者使用这种多路复用技术代表了一个优雅的工具来分析局部免疫浸润的多个细胞亚群, 这是重要的, 因为外周血分析不能代表局部肿瘤环境.
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Disclosures
所有作者没有利益冲突声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家杜邦癌症 (印加) (et)、甲组织癌症 (et)、大学大学巴黎太阳 (et)、Selectimmunco (et)、Labex 免疫肿瘤学 (et)、SIRIC CARPEM (CG 等) 赠款的资助。电子是由一个基金会的研究金弧形。EV 和 CD 由 APHP (交易所 année 研究) 的奖学金资助。慢性乙肝由大学索邦巴黎太阳 (合同博士) 的奖学金资助。作者感谢布里斯托尔迈尔斯宝在这个项目上的资助。作者感谢医院 europ 乔治蓬皮杜和尼克 (Laurianne Chambolle, Elodie 米歇尔和 Gisèle Legall) 的病理学系。作者感谢 PARCC, 医院 europ 乔治蓬皮杜 (科琳 Lesaffre) 的组织学平台。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24x60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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